QuickMutation?基因定點(diǎn)突變?cè)噭┖?/span>

     QuickMutation?基因定點(diǎn)突變?cè)噭┖?span>(QuickMutation? Site-Directed Mutagenesis Kit)可以快速完成質(zhì)粒DNA的點(diǎn)突變(point mutation)，多個(gè)鄰近密碼子的突變，單個(gè)或多個(gè)鄰近密碼子的缺失(deletion)或插入(insertion)突變。
      基因定點(diǎn)突變常用于研究基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、RNA或蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能，以及用于質(zhì)粒中部分序列的微調(diào)等。
      本試劑盒利用了目前*常用的基因點(diǎn)突變技術(shù)，只需通過基于PCR的突變質(zhì)粒的生成，和基于DpnI的模板質(zhì)粒的消化，轉(zhuǎn)化培養(yǎng)以及后續(xù)的酶切或測(cè)序鑒定，即可得到預(yù)期的突變質(zhì)粒 (參考圖1)。DpnI消化僅需5分鐘，累計(jì)操作時(shí)間不足2小時(shí)即可完成
基因的定點(diǎn)突變。

圖1.基因定點(diǎn)突變?cè)噭┖性韴D

      本試劑盒使用了*新的保真性更強(qiáng)，靈敏度更高，擴(kuò)增速度可達(dá)2kb/min，擴(kuò)增長(zhǎng)度可達(dá)12kb的BeyoFusion? DNA
Polymerase，從而大大縮短了突變反應(yīng)所需的時(shí)間，進(jìn)一步提高了基因定點(diǎn)突變的成功率。同時(shí)進(jìn)一步嚴(yán)格驗(yàn)證了試劑盒中的DpnI，確保能在5分鐘內(nèi)充分消化掉甲基化的模板質(zhì)粒，同時(shí)不會(huì)消化未甲基化的PCR產(chǎn)物。
      參考圖1，使用本試劑盒時(shí)需要先設(shè)計(jì)長(zhǎng)度通常為25-45個(gè)堿基互補(bǔ)的兩個(gè)引物，在引物中含有預(yù)期的突變位點(diǎn)。然后以待突變的質(zhì)粒為模板，用這兩個(gè)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。這樣可以產(chǎn)生含有預(yù)期的突變位點(diǎn)的雙鏈質(zhì)粒，但這個(gè)雙鏈質(zhì)粒中有兩個(gè)nick位點(diǎn)。待突變的質(zhì)粒通常來源于DH5α等dam⁺大腸桿菌，在這些dam⁺**中質(zhì)粒會(huì)被甲基化修飾，而在體外通過PCR擴(kuò)增得到的質(zhì)粒不會(huì)被甲基化。這樣用特異性識(shí)別甲基化位點(diǎn)的酶DpnI處理，可以消化掉待突變的質(zhì)粒模板，而使通過PCR擴(kuò)增出來的含有突變位點(diǎn)的質(zhì)粒被選擇性地保留下來。隨后把DpnI處理過的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)**后，突變質(zhì)粒中的兩個(gè)nick位點(diǎn)可以被大腸桿菌修復(fù)，得到的克隆就會(huì)含有預(yù)期的突變質(zhì)粒了。
      本試劑盒提供了DH5α甘油菌，可用于感受態(tài)**的制備。
      本試劑盒分別使用6kb和12kb的質(zhì)粒進(jìn)行了點(diǎn)突變測(cè)試，實(shí)測(cè)突變率接近100%(參考圖2)。實(shí)際進(jìn)行點(diǎn)突變時(shí)，可能會(huì)因?yàn)橥蛔円锏脑O(shè)計(jì)、模板使用量、感受態(tài)效率等因素出現(xiàn)不同的突變率。

      圖2. 本試劑盒實(shí)際使用效果圖。A. 使用本試劑盒進(jìn)行點(diǎn)突變獲得的LB平板照片。以一個(gè)6kb質(zhì)粒為模板，使用本試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增以實(shí)現(xiàn)點(diǎn)突變，DpnI 37℃消化5min，取10μl產(chǎn)物轉(zhuǎn)化100μl DH5α感受態(tài)，涂板后37℃培養(yǎng)過夜所獲得的LB平板照片。B. 陰性對(duì)照LB平板照片。與A相比沒有添加BeyoFusion? DNA Polymerase，這樣模板質(zhì)粒完全被DpnI酶所消化，沒有任何的假陽性克隆產(chǎn)生。C. 突變前后的測(cè)序圖。突變前的測(cè)序結(jié)果(WT, wild type)和從圖A中挑取9個(gè)克隆的測(cè)序結(jié)果(Mu,
mutant)。箭頭所示為擬突變的位點(diǎn)，紅色下劃線的為突變前和突變后的堿基。本次實(shí)驗(yàn)的突變率達(dá)到了100%。

      本試劑盒共可以進(jìn)行十次基因定點(diǎn)突變反應(yīng)。
包裝清單：

保存條件：
      -20℃保存，一年有效。
注意事項(xiàng)：
      需自行配制LB液體培養(yǎng)基和LB平板以用于**的培養(yǎng)。
      需自行設(shè)計(jì)和合成用于基因定點(diǎn)突變的引物。需自備用于**轉(zhuǎn)化的試劑。
      使用本試劑盒前請(qǐng)先閱讀后面的常見問題。
      本產(chǎn)品**于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或**，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
      為了您的**和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

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