自配ELISA試劑盒需嚴(yán)格把控試劑保存、操作流程、樣本處理、避免交叉污染等關(guān)鍵環(huán)節(jié)，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。

一、試劑配制與保存：

?緩沖液配制?：需使用高質(zhì)量蒸餾水或去離子水，自配緩沖液需用pH計(jì)校正（如Tris-HCl、PBS等），避免使用過期或變質(zhì)的試劑?。

?抗體/酶標(biāo)記物保存?：分裝后-20℃或-80℃保存，避免反復(fù)凍融；含甘油或BSA的保存液可降低蛋白變性風(fēng)險(xiǎn)。

?底物溶液避光?：TMB等顯色劑需現(xiàn)配現(xiàn)用，配制后立即避光保存，避免氧化失效。

二、樣本處理：

?樣本采集?：避免溶血、脂血，血清樣本需靜置后離心（3000 rpm，10分鐘）去除顆粒物?。

?保存條件?：新鮮樣本5天內(nèi)檢測(cè)，長(zhǎng)期保存需-20℃或-80℃分裝，凍融不超過3次。

?稀釋比例?：根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定*佳稀釋度，避免高濃度樣本導(dǎo)致Hook效應(yīng)。

?三、操作細(xì)節(jié)：

溫度控制：保持實(shí)驗(yàn)環(huán)境溫度在推薦范圍內(nèi)，避免溫度波動(dòng)影響反應(yīng)。

操作規(guī)范：佩戴實(shí)驗(yàn)服和手套，避免交叉污染，小心操作，防止樣本濺出。

實(shí)驗(yàn)記錄：詳細(xì)記錄每一步操作，包括試劑配制、孵育條件、洗滌次數(shù)等，以便于后續(xù)分析和問題排查。

四、質(zhì)量控制：

復(fù)孔檢測(cè)：對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行復(fù)孔檢測(cè)，計(jì)算平均值和CV值，確保結(jié)果的可靠性。

質(zhì)控品：使用質(zhì)控品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，監(jiān)控實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。

五、數(shù)據(jù)處理與分析：

建立標(biāo)準(zhǔn)曲線：使用標(biāo)準(zhǔn)品建立線性回歸，計(jì)算樣品濃度。

結(jié)果解讀：注意線性范圍，避免樣本濃度過高或過低導(dǎo)致偏離線性。

六、洗滌：

充分洗滌：每次孵育后徹底洗滌，去除未結(jié)合的分子，使用振蕩器幫助清洗。

避免殘留：確保洗液不殘留，影響后續(xù)反應(yīng)。

七、結(jié)論建議：

自配ELISA試劑盒的關(guān)鍵在于規(guī)范操作和嚴(yán)格管理試劑保存條件。以下幾點(diǎn)尤為重要：

1、使用前確保試劑平衡至室溫；

2、移液器和吸頭保持清潔干燥；

3、嚴(yán)格按照說(shuō)明書控制孵育時(shí)間和溫度；

4、避免試劑混合使用和樣本交叉污染；

5、標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)分裝保存，避免反復(fù)凍融。