PCR實驗步驟

PCR即聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）不僅是DNA分析*常用的技術(shù)，而且在DNA重組與表達、基因結(jié)構(gòu)分析和功能檢測中具有重要的應(yīng)用價值。

1.      PCR體系中的5個要素： 模板(Template)，引物(Primer)，酶(polymerase)，dNTP，緩沖液(Buffer，含有Mg2+)?，F(xiàn)在許多公司已推出酶、dNPT、Buffer配成的Mix Buffer，使用更為方便。

2.      20uL的PCR反應(yīng)體系：

模板DNA    2μL

引物1      1μL，10～100pmol

引物2      1μL，10～100pmol

dNTP      1.5μL，各200umol/L

MgCl2        2μL

10×buffer    2μL

ddH2O      10μL

Taq酶      0.5μL（2.5U）

在PCR管中依次加入上述溶液，Taq酶*后加入。 

3.      PCR反應(yīng)條件:

      預(yù)變性：95℃ 3min

      變性：95℃  45s

      退火：45℃ 45s 

      延伸： 72℃ 45s

      延伸完全：5min

      結(jié)束：4℃

      其中變性-延伸過程循環(huán)30次。

現(xiàn)在有些PCR因為擴增區(qū)很短,即使Taq酶活性不是*佳也能在很短的時間內(nèi)復(fù)制完成,因此可以改為兩步法,即退火和延伸同時在60℃-65℃間進行,以減少一次升降溫過程,提高了反應(yīng)速度.