關(guān)于定量PCR在低濃度模板擴(kuò)增時(shí)無目的產(chǎn)物

“GAPDH倒是在各個(gè)梯度都擴(kuò)增出了產(chǎn)物。但是這次有些奇怪，目的基因的熔解峰值怎么比GAPDH的峰值高了那么多？不知是什么原因？”

如果你之前GAPDH的產(chǎn)物長(zhǎng)度為250bp左右而現(xiàn)在為100bp左右的話很正常，因?yàn)門m在長(zhǎng)度一致的情況下GC含量起決定作用。如果長(zhǎng)度沒變過就要懷疑你**張圖中看到的GAPDH峰是否是引物二聚體了。其實(shí)在有懷疑的情況下只要將產(chǎn)物跑個(gè)膠，只要產(chǎn)物長(zhǎng)度正確就沒事了。

至于你說的低濃度擴(kuò)增不好的情況，這很正常。我覺得減小模板的稀釋梯度是比較快捷的方式（比如4倍稀釋）。退火溫度降低1-2℃，在反應(yīng)體系中加入氯化鎂之類的雖然也可以嘗試，但是比較麻煩。一般都是在普通PCR上先進(jìn)行優(yōu)化后再上定量的。但是我估計(jì)你用的是SYBR Green，這種染料對(duì)PCR本身有抑制作用，所以做好在定量PCR體系中直接摸索條件，但成本較高。還有一個(gè)可以嘗試的辦法就是換號(hào)些的酶，比如TAKARA的rTaq改成Ex Taq之類的。