分享自己關(guān)于qPCR（RT-PCR）數(shù)據(jù)相對定量的分析方法與經(jīng)驗！

qPCR的數(shù)據(jù)相對定量分析其實很簡單。我做了很多的qPCR實驗，也看了很多的資料，包括Nature protocol， AB官方的分析教程，MIQE，甚至包括一些商業(yè)化軟件使用的教程及教程里面記述的原理。

我在這里跟大家分享一下自己的經(jīng)驗，*常用，*普遍的相對定量方法就是2^-△△Ct法，該法**簡單的說就是：

首先將一次實驗的所有基因Ct值整理好，之后用每一組樣本自身的目的基因Ct值減去自身內(nèi)參基因Ct值，得到的數(shù)就是△Ct；換成公式就是：△Ct=Ct（目的基因）-Ct（內(nèi)參基因）；

然后，將每一組樣本每一個目的基因的△Ct都算好，整理進Excel，用本次實驗中待研究樣本的△Ct減去對照組樣本的△Ct，并同時對所有結(jié)果取相反數(shù)（就是加一個負運算，正數(shù)就變成負數(shù)，負數(shù)就變成正數(shù)），該步運算得到的結(jié)果就是-△△Ct。

*后，對-△△Ct進行2的冪運算，即2^-△△Ct就得出Fold Change。

但是，我想說的是2^-△△Ct得出的是Fold Change，不僅數(shù)據(jù)結(jié)果看上去不直觀反應實驗組與對照組目的基因mRNA的情況，同時還具有放大效應，所謂放大就是本來A基因的-△△Ct得到為2，B基因-△△Ct為4，兩者相差2，經(jīng)過2的冪運算之后，A基因為4，B基因為16，兩者相差12！

相對定量本身就存在放大的情況，若是再采取2^-△△Ct就只能說看看趨勢而已了，所以我在這里給大家推薦ABi官方的一個分析方法，就是log2R，就是log2為底對R求對數(shù)。當相對定量分析時，默認擴增效率E趨近或等于100%，這時候R就是2^-△△Ct，當然原本的R的公式我會在后面附上，感興趣的朋友可以自己去推導。

所以，我用的方法就是只計算到-△△Ct這一步就夠了，這樣得到的數(shù)據(jù)就有了正值與負值，正值表示較對照組mRNA上調(diào)，負值表示較對照組mRNA下調(diào)，作出圖來非常直觀，一目了然，也沒有放大效應，顯著性分析較為靠譜。這種運算方法*關(guān)鍵的在于負號以及實驗組和對照組要分清楚！要不就得到相反的結(jié)果。

附上R的完整公式： R=(1+E1)^△Ct1(Control-Sample)/(1+E2)^△Ct2(Control-Sample)

其中，E1：目的基因引物擴增效率；E2：內(nèi)參基因引物擴增效率；△Ct1：實驗組目的基因Ct值差；△Ct2：對照組目的基因Ct值差。 你觀察這個公式時候就???現(xiàn)，當擴增效率E為1（即100%）時，該公式就等于2^-△△Ct，這就是為什么會有2^-△△Ct方法的原因?。?！ ABi官網(wǎng)里的一款商業(yè)軟件能直接給出每次試驗每對引物的擴增效率E，能得到較為實際的R值，所以ABi的商業(yè)軟件會對R進行l(wèi)og2的運算，進而得到直觀的結(jié)果。