1.  接種一個單菌落于5 ml LB培養(yǎng)液，37℃溫和振搖培養(yǎng)5 h 或過夜。

2.   將2.5 ml 培養(yǎng)物加人到盛有500 ml LB培養(yǎng)液的2 L 燒瓶中，37℃搖勻振蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀為0.5~0.6。

 

3.  **在冰水浴冷卻10~15 min，然后轉(zhuǎn)移到預冷的1升離心瓶中。于2℃，5 000 g 離心20 min 沉淀用5 ml 預冷的水溶解6。

4.  加入500 ml 冰冷的水，混勻，按步驟3重復離心1次，立即將上清倒掉，用殘余的液體重懸細胞。

 

5.  新鮮制得的**

（1）將懸浮液加入到預冷的50 ml 聚丙烯管中，2℃，5 000 g 離心10 min。

（2）估計細胞沉淀的體積，沉淀用等體積的冰冷水重懸。

（3）按50~300 μl 分裝于預冷的微量離心管中。

6.  凍存**

（1）加入40 ml 冰冷的10%甘油，混合，然后按照步驟5離心。

（2）估計沉淀的體積，然后加入等體積的冰冷的10%甘油，重懸菌體。

（3）按50~300 μl 分裝于預冷的微量離心管中。

（4）于干冰上冷凍并貯存于-80℃。

7.  將電轉(zhuǎn)化儀調(diào)到2.5 kV、 25 μF ，脈沖控制器調(diào)到200~400Ω。

8.  將1 μl 質(zhì)粒DNA加入到盛有新鮮制備的**或融化的凍存**的小管中，混勻。

 

9.  將轉(zhuǎn)化混合物轉(zhuǎn)移到預冷的電轉(zhuǎn)化池中，吸干池的外表面，然后放入樣品槽中。
 

10.  進行脈沖電轉(zhuǎn)化，然后取出電轉(zhuǎn)化池，馬上加入1 ml SOC培養(yǎng)液，并且用巴斯德吸管轉(zhuǎn)移到無菌的培養(yǎng)管中。

11.  于37℃，中速振蕩培養(yǎng)30~60 min。

12.  分小份涂布于含有***的LB平板上。