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技術(shù)文章

大腸桿菌轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)Cacl2轉(zhuǎn)化法

Cacl2  轉(zhuǎn)化法

 實(shí)驗(yàn)材料



大腸桿菌

       

試劑、試劑盒


CaCl2 氨芐青霉素 LB

       

儀器、耗材



離心機(jī) 分光光度計(jì) 搖床


       

實(shí)驗(yàn)步驟





















1.  接種—個(gè)單菌落于50 ml LB培養(yǎng)液中，于37℃搖床培養(yǎng)過夜（250 r/min）。

2.  往一個(gè)2 L 的燒瓶中加入400 ml LB培養(yǎng)液，再加入4  ml 過夜培養(yǎng)液，于37℃；搖床，培養(yǎng)至OD590為0.375。

3.  將培養(yǎng)液分裝到8個(gè)50 ml 預(yù)冷無菌的聚丙烯管中，于冰上放置5~10 min，然后于4℃，1 600 g 離心7 min。
 
4.  細(xì)胞沉淀用10 ml 冰冷的CaCl2“溶液重懸，于4℃，以1 100 g 離心5 min 。

5.  細(xì)胞沉淀用10 ml 冰冷的CaCl2溶液重懸，冰上放置30 min，于4℃，1 100 g 離心5 min。
 
6.  用2 ml  冰冷的CaCl2溶液重懸各管細(xì)胞，然后按每管250 μl 的量分裝于預(yù)冷的無菌聚丙烯管中，立即凍存于- 70℃。

7.  按照以下各步驟用10 ng pBR322轉(zhuǎn)化100 μl 感受態(tài)**。

8.  將合適體積的轉(zhuǎn)化物涂于含有氨芐青霉素的LB平板上，37℃培養(yǎng)過夜。

9.  將10 ng 加入到一個(gè)15 ml 無菌的圓底試管中，并放置冰上。

10.  將盛有感受態(tài)細(xì)胞菌的管子握在手上使菌液迅速熔化。

11.  立即將100 μl 感受態(tài)**加 入到管中，輕輕旋動(dòng)，并放置冰上10 min 。

12.  將管故入42℃水浴2 min 進(jìn)行熱休克，然后加入1 ml LB 培養(yǎng)液于每一支試管中。

13.  于37℃置滾筒式搖床口培養(yǎng)1 h。

14.  將幾個(gè)稀釋度菌液涂布于含合適***的平板上，于37℃培養(yǎng)12~16 h。