熒光定量PCR概述
聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)自誕生之日起就決定了它不僅是一種高敏感、高特異的檢測核酸分子的定性方法，而且也是一個能對核酸分子進(jìn)行定量的有力工具。隨著分子生物學(xué)技術(shù)研究的不斷進(jìn)展，定量PCR技術(shù)取得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展，實時定量PCR (real-time quantitative PCR)技術(shù)便是一種具有**性意義的定量PCR技術(shù)。所謂實時定量PCR是指在PCR指數(shù)擴增期間通過連續(xù)監(jiān)測熒光信號強弱的變化來即時測定特異性產(chǎn)物的量，并據(jù)此推斷目的基因的初始量。
目前實時定量PCR作為一個極有效的實驗方法，已被廣泛地應(yīng)用于分子生物學(xué)研究的各個領(lǐng)域，僅2000-2001年，收錄在Medline上的以real-time PCR為關(guān)鍵詞的**就達(dá)1000多篇。實時PCR技術(shù)較之以前的以終點法進(jìn)行定量的PCR技術(shù)具有****的優(yōu)勢。，它不僅操作簡便、快速高效，而且具有很高的敏感性和特異性。其次，由于是在封閉的體系中完成擴增并進(jìn)行實時測定，大大降低了污染的可能性并且無須在擴增后進(jìn)行操作。
實時熒光定量PCR技術(shù)即是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。實時熒光定量PCR避免了傳統(tǒng)PCR以終產(chǎn)物檢測定量產(chǎn)生的偏差，提高實驗的重復(fù)性。該技術(shù)已被廣泛用于檢測細(xì)胞mRNA表達(dá)量的變化；比較不同組織的mRNA表達(dá)差異；驗證基因芯片，siRNA干擾的實驗結(jié)果。
基爾頓為您提供全套實時熒光定量PCR技術(shù)服務(wù)，全部實驗皆使用進(jìn)口試劑完成，定量PCR儀器為Corbett Research 公司生產(chǎn)的離心式實時定量PCR儀Rotor-Gene 3000。
熒光定量化學(xué)原理介紹
☆TaqMan熒光探針
PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團(tuán)和一個淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴增時，Taq酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成同步。
SYBR Green熒光染料
SYBR Green是一種DNA結(jié)合染料，能非特異地?fù)饺氲诫p鏈DNA中去。在游離狀態(tài)下，它不發(fā)出熒光，但一旦結(jié)合到雙鏈DNA中以后，便可以發(fā)出熒光。它的大優(yōu)點就是可以與引物、模板相配合，用于反應(yīng)體系中。從經(jīng)濟角度考慮，它也比其它的探針的價格要便宜得多。但由于它能與所有的雙鏈DNA結(jié)合，所以一旦反應(yīng)體系中出現(xiàn)非特異擴增，那它就會影響到定量結(jié)果的可靠性與重復(fù)性。要避免這種不利因素，可以通過選擇良好的引物并優(yōu)化反應(yīng)條件以消除非特異性影響。
熒光定量PCR中的一些術(shù)語
1. CT值：熒光信號有統(tǒng)計意義顯著增長(即穿過閾值線)時的循環(huán)次數(shù)，或者說是從基線到指數(shù)增長的拐點所對應(yīng)的循環(huán)次數(shù)。
2. 閾值：閾值的默認(rèn)設(shè)置是3-15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。
3.CT值與起始模板的量成線性關(guān)系。
主要實驗步驟如下：
1. 設(shè)計并合成Realtime PCR引物。
2. 引物溶解后使用Promega的TaqDNA聚合酶進(jìn)行含SG（SYBR® Green）的PCR反應(yīng)的優(yōu)化。
3. 客戶樣品RNA抽提
實驗對象為組織樣品，取適量（50-100mg）新鮮組織樣品或正存的組織樣品加1ml的RNA抽提試劑Trizol（Invitrogen），勻漿后抽提RNA。
實驗對象為細(xì)胞樣品，每份樣品取1×106～1×107細(xì)胞，PBS清洗細(xì)胞，去PBS加1ml的RNA抽提試劑Trizol（Invitrogen），裂解后抽提RNA
4. RNA質(zhì)量檢測
a. 紫外吸收測定法測定RNA在分光光度計260nm和280nm處的吸收值，以計算其濃度并評估RNA純度
b. 使用ambion公司的甲醛電泳試劑進(jìn)行變性瓊脂糖凝膠電泳，檢測RNA純度及完整性。
5. 使用逆轉(zhuǎn)錄酶（Promega）進(jìn)行反應(yīng)，將樣品RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。
6. 制備標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品：
進(jìn)行相對定量，需要先將樣品的目的基因以及管家基因進(jìn)行PCR擴增，其產(chǎn)物進(jìn)行梯度稀釋用于做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
7. 標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品和待測樣品分別加入到含SG的RealTime PCR反應(yīng)液中（其中TaqBeadTM熱啟動聚合酶來自Promega公司），進(jìn)行RealTime PCR擴增和檢測。
8. 檢測結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線分析：以對待測樣品的目的基因進(jìn)行定量。相對定量實驗需要進(jìn)一步用樣品的目的基因測得值除以管家基因測得值以校正誤差，所得結(jié)果代表某樣品的目的基因相對含量。
9. 提供實驗報告：包括詳細(xì)的實驗方法及實時熒光定量PCR實驗結(jié)果的相關(guān)圖表