反轉(zhuǎn)錄PCR（Reverse transcriptase PCR,RT-PCR）是一種從RNA擴(kuò)增cDNA拷貝的方法。RT-PCR對(duì)于獲得與克隆mRNA的5’、3’末端序列和從非常少量的mRNA樣品構(gòu)建大容量的cDNA文庫(kù)方面都是極為靈敏與通用的方法。此外，RT-PCR還易于鑒定已轉(zhuǎn)錄序列是否發(fā)生突變及呈現(xiàn)多態(tài)性，還可用于測(cè)定基因表達(dá)的強(qiáng)度。我公司采用二步RT-PCR法，可滿足客戶不同的實(shí)驗(yàn)要求。

樣品要求：提供的樣品要新鮮并盡可能多，不推薦提供RNA樣品，或者提供cDNA，并盡可能詳細(xì)的提供背景資料（基因序列、Genebank accession number擴(kuò)增產(chǎn)物的用途等）。

基本步驟

1. 模板制備：見RNA提取技術(shù)服務(wù)。

2.引物設(shè)計(jì)

   客戶提供上、下游引物，或者我公司提供的引物設(shè)計(jì)及合成（包括RT-PCR半定量檢測(cè)中的內(nèi)參引物）。

3. 反轉(zhuǎn)錄

（1）Microtube管中配制下列模板RNA/引物混合液，全量<15 μl。

試劑名稱                                                使用量

模板RNA                                                 2μg

Oligo(dT)12-18 Primer（50μM）                          2.5μl

（2）70℃保溫5分鐘后迅速在冰上急冷2分鐘以上。

（3）離心數(shù)秒鐘使模板RNA/引物的變性溶液聚集于Microtube管底部。

（4）在上述Microtube管中配制下列反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液。

試劑名稱                                         使用量

上述模板RNA/引物變性溶液

5×M-MLV Buffer                                  5μl

dNTP Mixture（各10 mM）                          1.25μl

RNase Inhibitor（40 U/μl ）                     25U

M-MLV（200 U/μl ）                              200U

RNase free dH2O                                  up to 25μl

42℃保溫1小時(shí)。

（5）70℃保溫15分鐘后冰上冷卻，得到cDNA溶液。

若需要表達(dá)，參考基因表達(dá)服務(wù)。若需要進(jìn)行RT-PCR半定量分析，接著以下的操作。

4.RT-PCR半定量分析

PCR擴(kuò)增目的基因及看家基因，產(chǎn)物經(jīng)過(guò)瓊脂糖凝膠電泳后進(jìn)行灰度掃描分析。