細(xì)胞培養(yǎng)的“奮斗史”

一、無菌

無菌的操作要**細(xì)胞培養(yǎng)中的頭等大事，從培養(yǎng)基到操作過程再到培養(yǎng)箱，不管哪一環(huán)節(jié)忽視了無菌的原則，細(xì)胞的損失必將慘重，甚至有可能全軍覆沒。 

1.超凈臺 

超凈臺可以看做是一個微型的無菌室，做好維護(hù)工作，就能提供一個不錯的無菌環(huán)境。在使用之前和之后，用70%-75%酒精棉，反復(fù)擦洗臺面。如果超凈臺處于人流較大的環(huán)境。在開啟超凈臺之前可在周圍噴70%-75%酒精。除此之外，也可用紫外燈**：經(jīng)常用的超凈臺開15分鐘便可，不經(jīng)常使用的超凈臺開半小時。

2、酒精燈

酒精燈的高溫灼燒可以消滅大多數(shù)的微生物，在操作過程中，玻璃制具（如移液管，玻璃管、10 ml移液槍頭等）都要注意在酒精燈上灼燒十多秒，等待冷卻再使用。而對于塑料一類的材料（如瓶塞等），也要在酒精燈前面過一下。

3、試劑

細(xì)胞培養(yǎng)中所用到一切試劑（如培養(yǎng)液、生長因子、抗性試劑、篩選的**等），都有遭受微生物污染的可能性，而試劑染菌是很大一部分染菌現(xiàn)象的根源。因而，使用試劑前好驗(yàn)菌，哪怕是**產(chǎn)品，用前也要驗(yàn)菌，用完還需拿封口膜將其封口。另外，試劑在冰箱放久了，再次使用前也要驗(yàn)菌。在這些小細(xì)節(jié)上多花一些時間，便可換來我們的安心。 

4、個人衛(wèi)生

實(shí)驗(yàn)者的個人衛(wèi)生情況對細(xì)胞培養(yǎng)成功與否也有很大的關(guān)系，比如隔離服、手套、口罩等清潔裝備，可以防止自帶的污染菌接觸細(xì)胞。東西要進(jìn)入超凈臺，可以用酒精棉擦拭以**。記住，要避免未經(jīng)****的東西與細(xì)胞相接觸！

二、培養(yǎng)條件的品質(zhì)

上等的硬件設(shè)施、培養(yǎng)試劑和實(shí)驗(yàn)耗材很大程度上可以細(xì)胞培養(yǎng)的順利進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)室如果有條件的話，所有的東西都盡量使用好的，比如：

1.硬件設(shè)施：好的超凈臺和生物**柜等。 

2.培養(yǎng)試劑：培養(yǎng)基、血清、胰酶、生長因子、抗性試劑、篩選的**等盡量使用進(jìn)口產(chǎn)品； 

3.實(shí)驗(yàn)耗材：培養(yǎng)皿、移液槍、槍頭等也盡量使用進(jìn)口產(chǎn)品。 

三、操作習(xí)慣

1.自己準(zhǔn)備一套個人的實(shí)驗(yàn)器具，不要和別人混用。

2.不管是買的細(xì)胞、還是惠贈的細(xì)胞，剛拿到手趕緊的做兩件事：

①　檢測是否有支原體污染；

②　迅速擴(kuò)增凍存。 

3.發(fā)現(xiàn)細(xì)胞有污染的跡象就迅速處理掉：**污染和**污染很容易發(fā)現(xiàn)，而支原體污染后，細(xì)胞會長的慢，買個支原體檢測的kit定期檢測一下。 

4.別怕浪費(fèi)，像槍頭之類的實(shí)驗(yàn)耗材，只要有可能污染就立即更換。

5.近換了什么新的東西稍微記一下，試劑一旦懷疑污染，馬上丟。 

6.實(shí)驗(yàn)時所用材料的位置擺放要順手，污染源和已**物品要分開放置。

7.動作要快，胰酶消化，換液等，細(xì)胞暴露在空氣中的時間越少越好。 

8.吹的時候，動作要既輕柔又有力。動作太重會有一堆一堆的氣泡，動作太輕就吹不下來。吹的時候槍里的培養(yǎng)基不要一次全都壓出來，留一點(diǎn)，槍的頭部盡量深的在液面以下。

9.對于嬌弱的細(xì)胞，要更細(xì)心呵護(hù)：胰酶消化不能過久，吹得時候要輕柔，離心時候也要注意轉(zhuǎn)速和時間，每天都要去看一下細(xì)胞——肉眼觀察培養(yǎng)基狀況、顯微鏡下觀察細(xì)胞生長狀況。 

10.離開過操作臺的東西再進(jìn)操作臺之前要用酒精噴一遍，包括一切實(shí)驗(yàn)耗材、儀器、以及你帶著手套的手。 

11.使用酒精燈時，別直接放到火上，離一段距離。

12.身體的各個部分盡量的少接觸不需要接觸的地方的地方，比如實(shí)驗(yàn)臺和培養(yǎng)箱內(nèi)部等。

13.實(shí)驗(yàn)結(jié)束后對實(shí)驗(yàn)臺的**、和細(xì)胞房日常的值日清潔是的，此外還要定期熏蒸。 

14.培養(yǎng)箱隔一段時間用酒精棉擦洗一次。

四．細(xì)胞傳代、凍存和復(fù)蘇 

細(xì)胞傳代是細(xì)胞培養(yǎng)比較重要的一環(huán)，傳代的好壞會影響細(xì)胞的生長狀態(tài)（傳代時機(jī)、傳代時間長短、傳代手法）；而細(xì)胞凍存和復(fù)蘇重要的就是慢凍速融。

1.一般細(xì)胞匯合度達(dá)到70%就可以進(jìn)行傳代。如果想要細(xì)胞狀態(tài)更好，可以在匯合度50%左右就進(jìn)行傳代。當(dāng)然接種的時候也相應(yīng)的減少數(shù)量，保持細(xì)胞生長周期在三天以上（傳代太頻繁，細(xì)胞狀態(tài)很差）。

2.傳代時細(xì)胞數(shù)量不可以太稀，傳的稀的細(xì)胞會長的特別慢；細(xì)胞密度也不能太大，到時候培養(yǎng)基營養(yǎng)不夠，出現(xiàn)凋亡細(xì)胞。 

3.細(xì)胞的傳代要規(guī)律，保持相同的頻率和傳代時間間隔，不要隨心所欲或者拖延。 

4.有時間的話，需要細(xì)胞計(jì)數(shù)：傳相應(yīng)數(shù)目的細(xì)胞到培養(yǎng)皿中，可以大致清楚細(xì)胞的生長曲線，不會臨時要處理，手足無措。 

5.不同細(xì)胞生長周期不同：有的生長很快（比如MDA-MB-231），傳代時取離心懸液的十分之一就已經(jīng)足夠了；有的生長很慢（比如BT474），傳代是一分二，復(fù)蘇起始的時候兩周多才能長滿，所以要在培養(yǎng)細(xì)胞的過程中多多摸索。 

6.細(xì)胞凍存前**習(xí)慣換液：通常是細(xì)胞傳代兩天后換液，然后第三天凍存細(xì)胞，主要是讓細(xì)胞保持對數(shù)生長狀態(tài)。 

7.凍存液：凍存液好現(xiàn)用現(xiàn)配。 

8.凍存盒：凍存盒用完好放在室溫中。很多同學(xué)用完凍存盒后，直接將其放到-80℃，下次凍存細(xì)胞接著用。這時候凍存盒本身已經(jīng)接近-80℃，里面的異丙醇已經(jīng)不能起到緩慢降溫的作用了。 

9.凍存細(xì)胞復(fù)蘇后**天好更換一次培養(yǎng)基。

10.每次開展相關(guān)實(shí)驗(yàn)的時候（**篩選等），鋪板和凍存一起做，就是鋪板的細(xì)胞同時凍存一批，如果實(shí)驗(yàn)結(jié)果不錯，后期可以馬上復(fù)蘇出來重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

五、其他注意事項(xiàng)

1.培養(yǎng)基的配制要做好梯度摸索并詳細(xì)記錄，否則細(xì)胞都不知道是怎么死的。 

2.細(xì)胞房不能進(jìn)去太多人，避免相互干擾。 

3.盡量提高操作熟練度，減少培養(yǎng)皿在培養(yǎng)箱外的滯留時間，細(xì)胞很脆弱，經(jīng)不起折騰。

4.把握好培養(yǎng)基更換的時間，不同細(xì)胞類型時間不同，早了浪費(fèi)試劑，晚了可能全軍覆沒。 

5.要做什么心里要非常清楚，合理安排時間，細(xì)胞房的實(shí)驗(yàn)穿**行，可以節(jié)省很多時間，也不會耽誤別人的實(shí)驗(yàn)。 

6.養(yǎng)細(xì)胞大的教訓(xùn)：不能偷懶！