反相液相色譜法

反相液相色譜是目前為止實驗室中使用*普遍的液相色譜分離技術(shù)，譜生分析儀器銷售多種廣受用戶喜愛的色譜柱產(chǎn)品。

*通用的色譜模式是反相色譜,它由極性流動相和非極性的固定相組成，典型的極性流動相是水或含極性溶劑的緩沖液，如甲醇，乙腈或四氫呋喃，非極性固定相是鍵合在硅膠或雜化顆粒上的烷基鍵。*近幾年，科學(xué)家門在色譜分離介質(zhì)的研究開發(fā)和應(yīng)用方面投入很多，以改變色譜柱分離效果，增加其pH穩(wěn)定性并提供互補(bǔ)的分離選擇性。

正相色譜法

在反相鍵合相推出之前，正相色譜是*流行的分離技術(shù)。它依賴于待分析物和固定相表面極性官能團(tuán)的相互作用，當(dāng)使用非極性溶劑作流動相時，這種相互作用*大。

正相色譜是一種非常強(qiáng)大的分離方法，因為有大范圍的溶劑選擇來調(diào)節(jié)分離選擇性。然而，由于正相色譜比較復(fù)雜，其應(yīng)用范圍也受到了限制。在某些情況下，平衡時間較長，重現(xiàn)性也不好，如流動相中低濃度的極性污染物會影響分析的靈敏度。如果這些問題得到控制，相比反相方法，正相色譜由于經(jīng)常使用低粘度溶劑，可得到更好的譜圖。

HILIC（親水相互作用色譜法）

親水相互作用色譜長期被人們使用，但是HILIC這個名詞僅僅是*近才被使用。分析物通常是極性化合物，如極性代謝物，碳水化合物或肽。

HILIC 可以被看作正相色譜向水性流動相領(lǐng)域的延續(xù)。流動相是水相緩沖液(< 40%)及有機(jī)溶劑。固定相是強(qiáng)親水性的極性吸附劑，如硅膠鍵合相，極性聚合物填料或離子交換吸附劑。這些固定相的共同特點是它們和水的作用力很強(qiáng)，因此屬于“親水性”。

HILIC模式使用的梯度和反相模式相反。初始條件包括高比例有機(jī)相，典型的濃度是95%有機(jī)相如乙腈，逐步降低到水相。因此，HILIC色譜又被稱為反反相色譜（reversed-reversed-phase）。

離子交換色譜法

離子交換色譜分離中，蛋白質(zhì)表面分布的凈電荷決定了蛋白與填料表面帶電官能團(tuán)的相互作用。蛋白質(zhì)表面的電荷必須與填料的電荷性質(zhì)相反才能發(fā)生相互作用?？梢钥刂频淖兞坑芯彌_液pH值，緩沖液濃度，梯度斜率和鹽濃度梯度，為優(yōu)化分離提供了一系列選擇。

分子排阻色譜法

生物分子在溶液中的實際大小和形狀不同是分子排阻色譜法的基礎(chǔ)，其分離機(jī)理是根據(jù)生物分子的尺寸不同在填料中的保留時間不同得以分離。分子排阻色譜常用的填料有大顆粒的葡聚糖凝膠、聚合物填料以及高效耐壓的小顆粒剛性填料等。

分子排阻色譜法在蛋白分離領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用，操作簡單。同時，也可用分子排阻色譜來做緩沖液交換，因為低質(zhì)量的鹽分子很容易同蛋白質(zhì)分開。

親和色譜法

親和色譜的原理是基于生物分子（例如，單克隆抗體或重組蛋白）與固定相配體的生物特異性相互作用而實現(xiàn)的。生物分子能得到生物活性的高回收率和較好的純度。現(xiàn)代親和色譜填料將堅固的耐堿填料，與增強(qiáng)的柱床穩(wěn)定性相結(jié)合，達(dá)到將粗提樣品從毫克至克級的高通量制備純化分離。

疏水相互作用色譜法

疏水相互作用色譜法是常用的蛋白分離模式，其分離機(jī)理是蛋白在高離子強(qiáng)度緩沖溶液條件下，蛋白質(zhì)溶解度降低，與中等疏水性的填料表面發(fā)生作用，然后將蛋白質(zhì)用降低離子強(qiáng)度的梯度進(jìn)行洗脫。該法分離度高，并能保持蛋白質(zhì)生物活性。疏水相互作用色譜使用水相緩沖液系統(tǒng)，緩沖液的鹽濃度和種類，緩沖液pH值，表面活性劑，改性劑，色譜柱溫度和填料都會影響分離度。由于蛋白質(zhì)在高離子強(qiáng)度下彼此也會發(fā)生相互作用，當(dāng)待分離原料已有部分純化時，可獲得更高的分離度。而且高離子強(qiáng)度下也不方便大體積樣品上樣，如在疏水色譜分離前用硫酸銨沉淀，則是很好的選擇。因此，疏水作用色譜是蛋白質(zhì)純化方案中很好的后續(xù)步驟。