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ELISPOT的操作方法
 
    (1)將適量捕獲性抗體預(yù)先包被于96孔ELISPOT板上，用膠帶封板并在4℃孵育過夜。將板用PBS洗6遍，再用含體積比10%胎牛血清(FCS)的培養(yǎng)基封閉，室溫下孵育至少1h。FCS可以封閉所包被抗體的FCS受體以降低非特異性反應(yīng)。有一種特殊的96孔板底面介質(zhì)是PVDF膜，利用膜的多孔結(jié)構(gòu)可以讓單個(gè)細(xì)胞坐到其中，然后分泌細(xì)胞因子或特定抗體，這樣使*后的檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞靈敏度成為可能。同時(shí)，PVDF膜的不透光性也是ELISPOT與ELISA 的不同之處。理論上是可以同時(shí)包被兩個(gè)不同的抗體的，兩種不同的抗體可以利用不同的顯色系統(tǒng)顯出不同顏色，但是這樣就要考慮到不同抗體間的不親和性，必需保證每種抗體包被的數(shù)量要足夠。如果是使用試劑盒的預(yù)包被板，這一步就可以省略啦。
    (2)將陰性對(duì)照和細(xì)胞樣品，如外周血單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)，經(jīng)純化的CD8+T細(xì)胞或去除某種特異細(xì)胞群的PBMC，用含10%FCS的培養(yǎng)基稀釋至5×104～2×105個(gè)/孔如果條件可以達(dá)到更高的細(xì)胞數(shù)，建議可以嘗試3×105～5×105個(gè)/孔，特別是在分泌細(xì)胞)，分裝于ELISPOT板孔中，再加入特異的刺激物，如多肽或基因表達(dá)產(chǎn)物，提取的抗原等，陰性對(duì)照孔中只加入培養(yǎng)基(實(shí)驗(yàn)中*好采用無血清的培養(yǎng)基，這樣可以避免因?yàn)檠迮尾煌牟町愃斐傻恼`差，同時(shí)也避免血清的某些成份會(huì)引起非特異的反應(yīng))，陽性對(duì)照孔加入植物血凝素(PHA，2μg/mL)或陽性多肽，37℃，體積比為5% CO2培養(yǎng)24～48h。要進(jìn)行ELISPOT實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞必需制備成為懸液的形式。利用ELISPOT的檢測(cè)是十分靈敏的，頻率低至10-12的分泌細(xì)胞都可以被檢測(cè)出來。并且對(duì)于那些會(huì)貼壁的細(xì)胞也可以使用此種方法，雖然細(xì)胞生長(zhǎng)貼壁后不易被洗去，但是不會(huì)妨礙*后斑點(diǎn)的顯色。只要細(xì)胞可以正常分泌與抗體特異結(jié)合的產(chǎn)物，這些產(chǎn)物會(huì)逐步擴(kuò)散到細(xì)胞四周，*后還是可以顯示出斑點(diǎn)。
    (3) 用含體積比0.01%Tween-20的PBS洗6次，以棄去細(xì)胞，加入生物素化抗細(xì)胞因子的檢測(cè)抗體，孵育3h。再洗6次后，加入AP或HRP標(biāo)記的鏈親和素，室溫孵育3h。
    (4) 用PBS-Tween-20 再洗5次，加入底物室溫下顯色，待出現(xiàn)紫色(AKP和底物的產(chǎn)物)或紅色(HRP和底物的產(chǎn)物)斑點(diǎn)時(shí)，即可用立體解剖顯微鏡或計(jì)算機(jī)輔助成像分析系統(tǒng)計(jì)算斑點(diǎn)數(shù)，并用斑點(diǎn)形成單位(sfu/L百萬加入細(xì)胞)記錄結(jié)果。每一個(gè)斑點(diǎn)代表一個(gè)特異分泌CK的細(xì)胞。若預(yù)先包被抗原，則可用于ASC測(cè)定，這時(shí)，每一個(gè)斑點(diǎn)代表一個(gè)分泌特異抗體的細(xì)胞。



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