Southern雜交可用來(lái)檢測(cè)經(jīng)限制性內(nèi)切酶切割后的DNA片段中是否存在與探針同源的序列,它包括下列步驟:
(1) 酶切DNA, 凝膠電泳分離各酶切片段,然后使DNA原位變性。
(2) 將DNA片段轉(zhuǎn)移到固體支持物(硝酸纖維素濾膜或尼龍膜)上。
(3) 預(yù)雜交濾膜,掩蓋濾膜上非特異性位點(diǎn)。
(4) 讓探針與同源DNA片段雜交,然后漂洗除去非特異性結(jié)合的探針。
(5) 通過(guò)顯影檢查目的DNA所在的位置。 　　
Southern雜交能否檢出雜交信號(hào)取決于很多因素,包括目的DNA在總DNA中所占的比例、探針的大小和比活性、轉(zhuǎn)移到濾膜上的DNA量以及探針與目的DNA間的配對(duì)情況等。在佳條件下,放射自顯影曝光數(shù)天后, Southern雜交能很靈敏地檢測(cè)出低于0.1pg與32 P標(biāo)記的高比活性探針的(>109 cpm/μg)互補(bǔ)DNA。如果將10μg基因組DNA轉(zhuǎn)移到濾膜上，并與長(zhǎng)度為幾百個(gè)核苷酸的探針雜交,曝光過(guò)夜,則可檢測(cè)出哺乳動(dòng)物基因組中1kb大小的單拷貝序列。　　
將DNA從凝膠中轉(zhuǎn)移到固體支持物上的方法主要有3種:
(1)毛細(xì)管轉(zhuǎn)移。本方法由Southern發(fā)明,故又稱為Southern轉(zhuǎn)移(或印跡)。毛細(xì)管轉(zhuǎn)移方法的優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)單,不需要用其他儀器。缺點(diǎn)是轉(zhuǎn)移時(shí)間較長(zhǎng),轉(zhuǎn)移后雜交信號(hào)較弱。
(2)電泳轉(zhuǎn)移。將DNA變性后,可電泳轉(zhuǎn)移至帶電荷的尼龍膜上。該法的優(yōu)點(diǎn)是不需要脫嘌呤/水解作用,可直接轉(zhuǎn)移較大的DNA片段。缺點(diǎn)是轉(zhuǎn)移中電流較大,溫度難以控制。通常只有當(dāng)毛細(xì)管轉(zhuǎn)移和真空轉(zhuǎn)移無(wú)效時(shí),才采用電泳轉(zhuǎn)移。
(3) 真空轉(zhuǎn)移。有多種真空轉(zhuǎn)移的商品化儀器,它們一般是將硝酸纖維素膜或尼龍膜放在真空室上面的多孔屏上,再將凝膠置于濾膜上,緩沖液從上面的一個(gè)貯液槽中流下,洗脫出凝膠中的DNA,使其沉積在濾膜上。該法的優(yōu)點(diǎn)是快速,在30分鐘內(nèi)就能從正常厚度(4-5mm)和正常瓊脂糖濃度

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