檢測三聚氰胺用高速冷凍離心機(jī)
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2.1儀器與條件
Agilent1100高效液相色譜儀(美國，Agilent公司);二極管陣列檢測器(DAD)，檢測波長240nm，柱溫：40℃。
(1)AgelaVenusilTMASBC18(4.6×250mm);緩沖液：10mM檸檬酸,10mM庚烷磺酸鈉;流動(dòng)相：緩沖溶液:乙腈=85:15;流速：1.0mL/min。
(2)AgelaVenusilTMASBC8(4.6×250mm);流動(dòng)相：緩沖液：乙腈=85：15;緩沖液：10mM檸檬酸，10mM辛烷磺酸鈉，調(diào)pH為3.0;流速：1.0mL/min;
離子交換固相萃取柱AgelaClearnertTMPCX(北京艾杰爾科技有限公司)
2.2試劑與樣品
寵物飼料樣品(農(nóng)業(yè)部飼料供應(yīng)中心);甲醇、乙腈為北京艾杰爾科技有限公司;氨水、乙酸鉛、三***、均購于北京化學(xué)試劑公司;三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品、檸檬酸、辛烷磺酸鈉(Sigma公司);甲醇為色譜純，其他均為化學(xué)純。
3實(shí)驗(yàn)方法
3.1樣品前處理方法
(1)標(biāo)準(zhǔn)樣品配制：
取50mg三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品，以20%甲醇溶解定容至50mL得到1000ppm的標(biāo)準(zhǔn)溶液，使用時(shí)，以提取液(0.1%三***)稀釋至所要的濃度。
(2)提?。?p> 稱取飼料樣品5g，加入50ml0.1%三***提取液，充分混勻，加入2mL2%乙酸鉛溶液，超聲20min。
然后取部分溶液轉(zhuǎn)移至10mL離心管中，8000rpm/min離心10min，取上清液3mL過混合型陽離子交換小柱(PCX)。
(3)凈化(PCX小柱，60mg/3mL)：
a)活化及平衡：3mL甲醇，3mL水
b)上樣：加入提取液3mL
c)淋洗：3mL水;3mL甲醇;棄去淋洗液并將小柱抽干。
d)洗脫：5mL5%氨化甲醇(v/v)洗脫。(5%氨化甲醇的配制：5mL氨水+95mL甲醇)。
e)濃縮：50℃，氮?dú)獯蹈桑?0%甲醇/水定容至2mL，HPLC分析或衍生后GC/MS分析。
3.2HPLC檢測方法
3.2.1三聚氰胺HPLC-UV檢測方法
三聚氰胺是強(qiáng)極性化合物，在傳統(tǒng)的反相C18柱上保留很差，需要用離子對試劑色譜方法才能有良好的保留與分離，按照美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)的三聚氰胺檢測方法和中國農(nóng)業(yè)部公布的三聚氰胺檢測方法，采用艾杰爾(Agela)ASB系列親水色譜柱，可以得到良好的分離效果，分析色譜圖如下：
圖2VenusilASB色譜柱分離三聚氰胺的譜圖
(a)色譜柱：VenusilASBC84.6×250mm;標(biāo)準(zhǔn)：FDA方法;流動(dòng)相：緩沖液：乙腈=85：15;緩沖液：10mM檸檬酸，10mM辛烷磺酸鈉，調(diào)pH為3.0;流速：1.0mL/min;柱溫：40oC;波長：240nm
(b)色譜柱：VenusilASB-C184.6×250mm;標(biāo)準(zhǔn)：中國農(nóng)業(yè)部頒標(biāo)準(zhǔn)方法;緩沖液：10mM檸檬酸,10mM庚烷磺酸鈉;流動(dòng)相：緩沖溶液:乙腈=85:15;流速：1.0mL/min;柱溫：40℃;波長：240nm
空白加水平(mg/L)回收率0.01116%0.1108%0.592%296%
3.2.2三聚氰胺LC-MS檢測方法
由于FDA公布的HPLC-UV方法中，流動(dòng)相添加了離子對試劑，因此限制了液質(zhì)聯(lián)用方法的使用;但不用離子對試劑色譜方法，三聚氰胺在傳統(tǒng)的C18柱上保留很差，不能得到較好的分離定量〔3〕。
基于此問題，艾杰爾科技公司自主開發(fā)了新的方法，采用艾杰爾(Agela)ASB系列親水色譜柱，不用離子對試劑也能得到有效的保留與分離。因此方法中流動(dòng)相不含離子對試劑，可以用于質(zhì)譜檢測。
與FDA2007年4月公布的《UpdatedFCCDevelopmentalMelamineQuantitation(HPLC-UV)》相比較，該方法大大降低了低檢測限(MSD：0.5ppm;UV：2ppm)，提高了檢測靈敏度。
以該方法分別在ASB-C84.6×250mmASB-C184.6×250mm得到的譜圖如下：
圖3LC-MS方法檢測三聚氰胺的譜圖
緩沖液：10mM的NH4AC;流動(dòng)相：Buffer:：ACN=95：5;流速：1.0mL/min;進(jìn)樣量：樣品先用70%ACN溶解成約1mg/mL，用ACN稀釋成0.1mg/mL，進(jìn)10uL;柱溫：40℃;波長：240nm
4結(jié)果與討論
4.1陽離子交換柱(PCX)
三聚氰胺呈弱堿性(弱陽離子化合物)，凈化過程一般應(yīng)選擇陽離子交換柱?；旌闲偷年栯x子交換柱(PCX)通過將磺酸基團(tuán)(-SO3H)鍵合在極性高聚物聚苯乙烯/二乙烯苯(PEP)吸附劑上，具有陽離子交換和反相吸附兩種機(jī)理，并具有以下優(yōu)點(diǎn)：
a)可通過兩種不同溶液的洗滌(水/一定pH值的緩沖溶液和有機(jī)溶劑)，使樣品更干凈，提高檢測的靈敏度。
b)批次重復(fù)性好。
c)回收率高，重現(xiàn)性好，即使小柱跑干也可以得到較高回收率。
4.2LC-MS方法優(yōu)點(diǎn)：
(1)檢測過程簡便：無須添加離子對試劑，三聚氰胺就可得到良好的保留與分離，避免了配制離子對流動(dòng)相的復(fù)雜過程。
(2)提高了檢測的靈敏度：無離子對試劑，可以用于質(zhì)譜檢測器，大大降低了低檢測限(MSD：0.5ppm;UV：2ppm)。
(3)降低了檢測成本：不用離子對試劑，就不再需要買價(jià)格較貴的離子對試劑了，從而降低了檢測成本。
(4)延長了色譜柱的使用壽命：避免了使用離子對試劑減少色譜柱壽命的影響。
(5)該方法所使用的色譜柱具有通用性：無論是用FDA方法、中國農(nóng)業(yè)部部頒標(biāo)準(zhǔn)方法和本公司開發(fā)的LC-MS方法，使用艾杰爾(Agela)ASB系列親水色譜柱均能得到一個(gè)很好的檢測結(jié)果，從而給客戶了多種選擇空間。
國家食品質(zhì)量監(jiān)督檢測中心有關(guān)人士說，在現(xiàn)有的國家標(biāo)準(zhǔn)奶粉檢測中，主要進(jìn)行蛋白質(zhì)、脂肪、**等檢測。三聚氰胺屬于化工原料，是不允許添加到食品中的，所以現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)不會(huì)包含相應(yīng)內(nèi)容。也就是說，三聚氰胺不屬于常規(guī)檢測項(xiàng)目，正常情況下，很少有人會(huì)想到去檢測它
上海金鵬分析儀器有限公司
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