支原體污染是細(xì)胞培養(yǎng)中常見的問題，它可能對細(xì)胞的生長、代謝、實驗結(jié)果準(zhǔn)確性產(chǎn)生嚴(yán)重影響，甚至導(dǎo)致實驗失敗。由于支原體污染通常沒有明顯的外觀變化，因此預(yù)防顯得尤為重要。以下是一些關(guān)鍵步驟：

一、源頭控制

從可靠供應(yīng)商獲取無支原體細(xì)胞系。

新引入的細(xì)胞需在隔離培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，并進行支原體檢測，確認(rèn)陰性后方可與其他細(xì)胞共用。

定期篩查工作細(xì)胞庫中的支原體污染情況，建議每3-6個月檢測一次

二、選擇無菌試劑和耗材：

1、使用來自可靠供應(yīng)商的無菌培養(yǎng)基、血清和添加物。

2、血清是支原體污染的高發(fā)品，選擇經(jīng)過支原體檢測合格的批次。

3、對于血清，可以考慮56℃、30分鐘的滅活處理，但需注意熱敏成分的穩(wěn)定性。

4、確保所有耗材，如培養(yǎng)瓶、離心管、移液器吸頭等，經(jīng)過高壓**或γ射線**，并且包裝完好、不過期。

5、使用帶濾芯的移液器吸頭，以防止移液時產(chǎn)生的氣溶膠造成污染。

三、規(guī)范細(xì)胞培養(yǎng)操作：

遵守?zé)o菌操作原則，穿戴無菌實驗服、手套、口罩，避免手部直接接觸培養(yǎng)體系。

在生物**柜中進行細(xì)胞操作，操作前用75%乙醇擦拭工作臺面，開啟紫外燈**30分鐘，操作時關(guān)閉紫外燈。

移液時避免吸頭碰到瓶口、管口。

四、定期檢測支原體

可采用PCR檢測試劑盒、熒光染色法（如DAPI染色）或ELISA等方法檢測支原體。

若發(fā)現(xiàn)污染，立即隔離可疑細(xì)胞，并使用支原體**試劑進行處理；嚴(yán)重污染建議丟棄。

五、定期檢測與動態(tài)監(jiān)控：?

?雙重檢測技術(shù)?：結(jié)合培養(yǎng)法（14~28天）與快速檢測（如MycoAlert發(fā)光法），覆蓋可培養(yǎng)及不可培養(yǎng)支原體。

?頻率要求?：連續(xù)傳代細(xì)胞每月檢測一次，病毒種子批、原液等關(guān)鍵節(jié)點需全流程監(jiān)控。

六、?應(yīng)急與維護策略：?

1、?污染處理?：立即隔離污染培養(yǎng)物，啟動*****（如BM-Cyclin方案），**后需3輪復(fù)檢確認(rèn)無復(fù)發(fā)。

2、?長期防護?：建立主細(xì)胞庫（MCB）和工作細(xì)胞庫（WCB），禁用***作為常規(guī)添加劑以避免耐藥性。

通過“防-檢-治”三位一體策略，可顯著降低支原體污染風(fēng)險。?