細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點：

1.研究的對象是活細(xì)胞

在實驗過程中，根據(jù)要求可始終保持細(xì)胞活力，并可長時間監(jiān)控、檢測甚至定量評估一部分活細(xì)胞的情況，包括活細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生命活動等。

2.研究條件可以人為控制

pH、溫度、氧氣、二氧化碳、張力等物理化學(xué)的條件，可以根據(jù)實際需要進(jìn)行人為的控制，同時，可以施加化學(xué)、物理、生物等因素作為條件而進(jìn)行實驗觀察，這些因素同樣可以處于嚴(yán)格控制之下。

3.研究的樣本可以達(dá)到比較均一性

通過細(xì)胞培養(yǎng)一定代數(shù)后，所得到的細(xì)胞系則可以達(dá)到均一性而屬于同一類型的細(xì)胞，需要時，可采用克隆化等方法使細(xì)胞達(dá)到純化。

4.研究內(nèi)容便于觀察、檢測和記錄

采用各種研究技術(shù)：如倒置生物顯微鏡、熒光顯微鏡、電子顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)、激光共焦顯微鏡、組織化學(xué)、原位雜交、同位素標(biāo)記等各種儀器設(shè)備。

培養(yǎng)操作：

1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有 1mL 細(xì)胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，加 入 4mL 培養(yǎng)基混合均 勻。在 1000RPM 條件下離心 4 分鐘，棄去上清液，補(bǔ) 加 1-2mL 培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培 養(yǎng)過夜（或?qū)?細(xì)胞懸液加入 10cm 皿中，加入約 8ml 培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。天換液并 檢查細(xì)胞密度。

2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá) 80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。      

1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的 PBS 潤洗細(xì)胞 1-2 次。

2. 加 1ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于 37℃培 養(yǎng)箱中消化 1-2 分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分 變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng) 瓶后加少量培養(yǎng)基終止消 化。  

3. 按 6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在 1000RPM 條件下離心 4 分 鐘，棄去上清液，補(bǔ)加 1-2mL 培養(yǎng)液后吹勻。

4. 將細(xì)胞懸液按 1：2 比例分到新的含 8ml 培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

3）細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面 T25 瓶為類；

1. 細(xì)胞凍存時，棄去培養(yǎng)基后，PBS 清洗一遍后加入 1ml 胰酶，細(xì)胞變圓 脫 落后，加入 1ml 含血清的培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計數(shù)板計數(shù)。

2. 4 min 1000rpm 離心去掉上清。加 1ml 血清重懸細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加入血清和 DMSO，輕輕混勻，DMSO 終濃度為 10%，細(xì)胞密度不低于1x106/ml，每支凍存管凍存 1ml 細(xì)胞懸液，注意凍 存管做好標(biāo)識。

3. 將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80 度冰箱，2 個小時以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取.

細(xì)胞處理方法：

以下細(xì)胞處理方法及細(xì)胞說明書僅供參考，具體操作還需要根據(jù)到貨時細(xì)胞密度，細(xì)胞生長狀態(tài)等具體情況，酌情處理，如需要更詳細(xì)技術(shù)指導(dǎo)。

一．貼壁細(xì)胞

客戶接收到細(xì)胞，用75%的酒精（建議配制75%酒精的水是過的）培養(yǎng)瓶外部。

肉眼觀察細(xì)胞培養(yǎng)基顏色，顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況，并對細(xì)胞進(jìn)行不同倍數(shù)拍照（建議收到時的培養(yǎng)瓶拍一張照片，顯微鏡拍收到時的細(xì)胞100X ,200X 各一張）。

顯微鏡觀察細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞融匯至80%左右（可以傳代的情況下），細(xì)胞應(yīng)該在37度培養(yǎng)箱預(yù)溫1-2h后再做處理。如未達(dá)到細(xì)胞傳代密度，培養(yǎng)瓶應(yīng)預(yù)留一部分培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

嚴(yán)格無菌操作，打開細(xì)胞培養(yǎng)瓶。

將細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)基用吸管完全吸出（嚴(yán)禁直接傾倒），放入另一無菌容器中（建議換新的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞）。

用PBS 2-3ml/次輕輕洗細(xì)胞表面，加入適量的0.05%胰酶-EDTA消化細(xì)胞,顯微鏡下觀察細(xì)胞變圓，輕輕拍打培養(yǎng)瓶直到細(xì)胞脫落，加入終止液終止。1000rpm,5min離心，重懸細(xì)胞。換新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶，37℃,5%CO2  培養(yǎng)。

二．懸浮細(xì)胞

1. 接收到細(xì)胞，用75%的酒精（建議配制75%酒精的水是過的）培養(yǎng)瓶外部。

2. 肉眼觀察細(xì)胞培養(yǎng)基顏色，顯微鏡觀察細(xì)胞生長情況，并對細(xì)胞進(jìn)行不同倍數(shù)拍照（建議收到時的培養(yǎng)瓶拍一張照片，顯微鏡拍收到時的細(xì)胞100X ,200X 各一張）。

3. 嚴(yán)格無菌操作，打開細(xì)胞培養(yǎng)瓶。

4. 將細(xì)胞培養(yǎng)瓶內(nèi)的培養(yǎng)基用吸管完全吸出（嚴(yán)禁直接傾倒）。

5. 1000rpm,5min離心，重懸細(xì)胞。 換新的細(xì)胞培養(yǎng)瓶和新鮮培養(yǎng)基，37℃,5%CO2培養(yǎng)。

冷凍保存細(xì)胞之方法

冷凍保存方法一: 冷凍管置于4℃ 30~60 分鐘→ （-20 ℃30 分鐘*） → -80 ℃16~18 小時（或隔夜） → 液氮槽vaporphase 長期儲存。

冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設(shè)定程序之可程序降溫機(jī)中每分鐘降1-3 ℃ 至–80 ℃ 以下， 再放入液氮槽vapor phase長期儲存。-20 ℃不可超過1 小時， 以防止冰晶過大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80℃ 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

胰酶-EDTA，（10X）
0. 5%胰酶，EDTA。4Na人間充質(zhì)干-骨髓微RNA三苯基膦化釕IL-23R(Interleukin-23 receptor)  白介素-23受體抗原
胰酶-EDTA，
0.25%胰酶，EDTA。4Na人間充質(zhì)干-脂肪微RNA三苯基膦化釕IL-1 Alpha (Interleukin-1 Alpha )  白介素1α抗原
人間充質(zhì)干-肝臟微RNA三苯基膦化釕IL-2 (Interleukin-2)Mouse、Ret  白介素2抗原（大、鼠）
胰酶（1：250），干人臍帶間充質(zhì)干微RNA4-二甲氨基肉桂IL-2 (Interleukin-2)Human  IL-2抗原（人）
DPBS，（1X）（IVD）人肺間充質(zhì)干微RNA4-二甲氨基肉桂IL-23(Interleukin-23)  白介素-23抗原
人上皮微RNA甲基-1-硫代-Β-D-半乳糖苷IL-4(Interleukin-4)  白介素4抗原
人成纖維微RNA10-(2-Benzothiazolyl)-2,3,6,7-Tetrahydro-1,1,7,7-Tetramethyl-1H,5H,11H-(1)Benzopyropyrano(6,7-8-I,j)Quinolizin-11-OneIL-4(Interleukin-4)human peptide  白介素4抗原
DPBS，（1X），（IVD）人臍靜脈內(nèi)皮微RNA1-(3-三基)IL-5 peptide  白介素5抗原
人臍動脈內(nèi)皮微RNA1-乙基-3-甲基咪唑六磷鹽[用于熔鹽]IL-6 (Interleukin-6) Human  白介素6
DPBS，（10X），（IVD）人臍靜脈平滑肌微RNA1-乙基-3-甲基咪唑六磷鹽[用于熔鹽]IL-7(Interleukin-7)  白介素7抗原
PBS，（1X）人臍動脈平滑肌微RNA3-基吡唑-4-羧乙酯IL-6R Alpha (IL6R-alpha)  白介素6受體α抗原
橄欖苦苷3-基吡唑-4-羧乙酯gp130/IL-6R  白介素-6受體抗原
PBS，（10X）黨參炔苷3-基吡唑-4-羧乙酯IL-7Ra/CD127 peptide  白介素-7受體a抗原
PBS，（1X）鼠尾草N,N,N',N'-四苯基聯(lián)苯胺ING1/p33(inhibitor of growth gene 1)  生長抑制因子基因1抗原
迷迭香N,N,N',N'-四苯基聯(lián)苯胺Inhibin Alpha  抑制素α抗原
PBS，（10X）黃豆黃苷N,N,N',N'-四苯基聯(lián)苯胺Inhibin beta A peptide  抑制素beta A抗原
RPMI 1640，（1X），液體（IVD）黃豆黃素(R)-1,1′-聯(lián)萘-2,2′-二基磷酰Inhibin beta B  抑制素βB抗原
RPMI 1640，（1X），液體（IVD）大豆苷(R)-1,1′-聯(lián)萘-2,2′-二基磷酰Integrin Alpha3  整合素α3抗原
RPMI 1640，干
（IVD）大豆苷元雙(六乙酰)合銅(II)Integrin Beta5  整合素β5抗原
染料木素雙(六乙酰)合銅(II)Integrin alpha 1  整合素α1抗原
RPMI 1640，干
（IVD）染料木苷3-甲氧基苯硫酚Integrin Alpha4 Beta7/LPAM-1 (Lymphocyte Peyer’s patch Adhesion Molecule 1/Integrin alpha4,beta7)  整合素α4β7抗原
RPMI 1640，（1X），液體 （ IVD）歐前胡素3-甲氧基苯硫酚Integrin AlphaE2/CD103  整合素αE2抗原
DMEM（低糖），液體異歐前胡素3-甲氧基苯硫酚ENPP3/CD203c(ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 3)  ENPP3抗原
DMEM（低糖），干遠(yuǎn)志L-(-)-半乳糖IQGAP1  支架蛋白抗原
DMEM（高糖），液體遠(yuǎn)志皂苷元L-(-)-半乳糖IRF-1(Interferon regulatory factor-1)  干擾素調(diào)節(jié)因子抗原
萊苞迪甙A釓(III)IRAK 2  白介素-1受體相關(guān)激酶2
DMEM（高糖），液體黃芩苷4,6-二甲基嘧IL-1RA (Interleukin-1 receptor antagonist)peptide  白介素-1受體拮抗劑抗原
DMEM（高糖），液體野黃芩苷（燈盞花乙素）(甲基)甲基二硅烷Integrin a7(integrin alpha 7)  整合素α7抗原
DMEM（高糖），干黃芩素(甲基)甲基二硅烷integrin Beta1(ITG- Beta1/CD29)  粘附分子整合素β1抗原
大鼠視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞秦皮素2-(2H-Tetrazol-5-yl)-Phenylboronic AcidIntegrin Alpha5(ITG- AlphaV/CD49e)  粘附分子整合素α5抗原
DMEM（高糖），干秦皮甲素2-(2H-Tetrazol-5-yl)-Phenylboronic AcidIntegrin alpha V/CD51 peptide  整合素αV抗原
秦皮乙素2-溴-1,3-二-5-苯JAK1(Tyrosine-protein kinase JAK1; Janus kinase 1)  蛋白質(zhì)酪氨激酶JAK-1抗原