培養(yǎng)方法

傳代方法 將舊培養(yǎng)液吸除，PBS清洗兩遍后，加入6mL（/100mm皿）胰酶，在顯微鏡下觀察，期間禁止搖晃培養(yǎng)皿，細胞剛有脫落時，則吸除大部分胰酶，留約0.5mL，移至培養(yǎng)箱消化，約2min取出。傳代用12mL CM1-1培養(yǎng)液終止消化，輕輕吹打均勻細胞，后可分3~6皿培養(yǎng)；

生長條件 37℃，5%CO2，CM1-1培養(yǎng)液。CM1-1培養(yǎng)液：90%DMEM-H+10%FBS。DMEM-H：DMEM高糖培養(yǎng)液，含谷氨酰胺，含丙酮酸鈉。

存儲條件 凍存則用6mL凍存液（90%FBS+10%DMSO）終止消化，吹打均勻，分為6支凍存管，用程序降溫盒于-80℃凍存，過夜轉(zhuǎn)移至液氮中保存。

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培養(yǎng)操作步驟 ：

1．用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布； 

2．將蓋玻片輕輕放入6孔培養(yǎng)板（每孔一片）或培養(yǎng)皿中（每個平皿可放置2-3片）； 

3．在距離紫外燈直射范圍內(nèi)20-30 厘米處照射2-3小時； 

4．將經(jīng)過計數(shù)的細胞懸浮液移入培養(yǎng)板中，使蓋玻片完全浸在培養(yǎng)液中； 

5．將培養(yǎng)板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當貼壁細胞生長至覆蓋培養(yǎng)板底部2/3面積時，將培養(yǎng)板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進行快速固定以及細胞化學(xué)檢測。 

細胞培養(yǎng)方法：

1、細胞傳代：細胞密度達到80-90%時即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%胰酶（T25瓶），使胰酶覆蓋整個瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，若大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入完全培養(yǎng)基終止消化；若細胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細胞直接離心收集，細胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2、細胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補加適量培養(yǎng)基。

3、細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時進行細胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%胰蛋白酶（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細胞，大部分細胞回縮且有少量細胞脫落，輕輕吹打下確認消化情況后加入完全培養(yǎng)基終止消化；

③將細胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲存。

優(yōu)級胎牛血清 綠原1-溴-2,3,5,6-四苯JAK2(Tyrosine-protein kinase JAK2; Janus kinase 2; JAK-2)  蛋白質(zhì)酪氨激酶JAK-2抗原
新綠原（5-咖啡酰奎寧）1-溴-2,3,5,6-四苯phospho JAK2(phospho-Tyr1007+Tyr1008)  磷化蛋白酪氨激酶JAK-2抗原
ES級別胎牛血清隱綠原（4-咖啡?？鼘帲?-溴-2-JNK1/3 (c-Jun amino-terminal kinase 1/3)  c-Jun氨基末端激酶1/3多肽抗原
新生牛血清異綠原A（3,5-二咖啡酰奎寧）順-二雙(三苯基膦)鉑(II), Pt minphospho-JNK1/2/3(pThr183/pTyr185) peptide  磷化氨基末端激酶1/2/3（pJNK1/2/3）抗原
異綠原B（3,4-二咖啡?？鼘帲╉?二雙(三苯基膦)鉑(II), Pt minKi-67(Antigen identified by monoclonal antibody Ki 67)  Ki-67 Antigen
馬血清異綠原C（4,5-二咖啡酰奎寧）烯基三苯基溴化磷Klf4 (Kruppel likefactor 4)  腸道內(nèi)富含的Kruppel樣因子抗原
1-咖啡?？鼘幭┗交寤譸hospho-KLF5/Krueppel-like factor 5 (pSer272)  磷化腸道內(nèi)富含的Kruppel樣因子5抗原
熱滅活馬血清洋薊素（1,3-二咖啡酰奎寧）苯酚三水合物phospho-Klf5/CKLF/Kruppel like factor 5, Human, mo, rat, horse, bovine, rabbit, pig, dog  磷化腸道內(nèi)富含的Kruppel樣因子5抗原
1,5-二咖啡?？鼘幈椒尤衔風(fēng)DH(Lactate Dehydrogenase)  乳脫氫酶抗原
山羊血清巴馬?。S藤素，棕櫚）順-二(苯甲)二鉑(II)Leptin receptor  瘦素受體
橙皮苷2-羥基乙基磺PAFAH2/Lp-PLA2/PLA2G7(plaet-activating factor acetylhydrolase 2)  脂蛋白磷脂酶A2抗原
菌顯色培養(yǎng)基新橙皮苷2-羥基乙基磺Lgr5/GPR49  腸上皮干蛋白（多肽）
柴胡皂苷B2-羥基乙基磺LH(Luteinizing Hormone)  促黃體**素抗原
定位顯色培養(yǎng)基橙皮素[1,3-雙(二苯基膦)烷]二化鎳(II)LH(Luteinizing Hormone)  人促黃體**素(多肽)
穿心蓮內(nèi)酯[1,3-雙(二苯基膦)烷]二化鎳(II)LH/CG Receptor(Luteinizing Hormone/Choriogonadotropin Receptor)  人促黃體**素受體抗原
大腸桿菌顯色培養(yǎng)基甘草六磷(7-氮雜苯并三唑-1-氧基)三吡咯烷磷L-HDC (L-Histidine decarboxylase)  L-組氨脫羧酶抗原
甘草次六磷(7-氮雜苯并三唑-1-氧基)三吡咯烷磷LIF peptide  白血病抑制因子抗原
ECC顯色培養(yǎng)基甘草單銨鹽六磷(7-氮雜苯并三唑-1-氧基)三吡咯烷磷LIFR/CD118 peptide  白血病抑制因子受體抗原
甘草苷六磷7-氮雜苯并三唑-1-氧基三(二甲氨基)磷(AOP)Lingo-1  Nogo受體作用蛋白抗原
O157顯色培養(yǎng)基異甘草苷六磷7-氮雜苯并三唑-1-氧基三(二甲氨基)磷(AOP)LIS1(Lissencephaly-1 protein)  無腦回的致病基因LIS1抗原
兔T**細胞甘草素/甘草三(2,2,6,6-四甲基-3,5-庚二)釔(III)LFABP/FABP-1(Liver Fatty acid binding protein)  肝臟型脂肪結(jié)合蛋白抗原
O157顯色培養(yǎng)基（改進型）大黃9-溴蒽LFABP/FABP-2(Liver Fatty acid binding protein)  肝臟型脂肪結(jié)合蛋白抗原
O104顯色培養(yǎng)基大黃素9-溴蒽LN (laminin)  層粘連蛋白(多肽抗原)
金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基大黃素甲9-溴蒽Laminin Beta1 peptide  層粘連蛋白β1抗原

實驗要點及說明：

1．本方法適用于貼壁細胞培養(yǎng)，而不適用于懸浮細胞培養(yǎng)，懸浮細胞可使用滴片法； 

2．所使用的蓋玻片應(yīng)該為玻璃**，并經(jīng)過鉻酸洗液處理； 

3．蓋玻片非常薄，易碎，取放蓋玻片時動作要輕； 

4．如果需要更多生長狀態(tài)一致的細胞，可以使用較大的培養(yǎng)皿，但不宜過大，以避免培養(yǎng)液的浪費和增加污染機率； 

5．如果細胞貼壁生長能力較差，可將蓋玻片在0.5%多聚賴氨酸溶液中浸泡5-10分鐘并自然晾干。

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