培養(yǎng)方法

傳代方法 將舊培養(yǎng)液吸除，PBS清洗兩遍后，加入6mL（/100mm皿）胰酶，在顯微鏡下觀察，期間禁止搖晃培養(yǎng)皿，細(xì)胞剛有脫落時(shí)，則吸除大部分胰酶，留約0.5mL，移至培養(yǎng)箱消化，約2min取出。傳代用12mL CM1-1培養(yǎng)液終止消化，輕輕吹打均勻細(xì)胞，后可分3~6皿培養(yǎng)；

生長(zhǎng)條件 37℃，5%CO2，CM1-1培養(yǎng)液。CM1-1培養(yǎng)液：90%DMEM-H+10%FBS。DMEM-H：DMEM高糖培養(yǎng)液，含谷氨酰胺，含丙酮酸鈉。

存儲(chǔ)條件 凍存則用6mL凍存液（90%FBS+10%DMSO）終止消化，吹打均勻，分為6支凍存管，用程序降溫盒于-80℃凍存，過(guò)夜轉(zhuǎn)移至液氮中保存。

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培養(yǎng)操作步驟 ：

1．用蓋片鑷將蓋玻片自75%乙醇中取出，用無(wú)菌絲綢布擦拭干凈，不要用紗布； 

2．將蓋玻片輕輕放入6孔培養(yǎng)板（每孔一片）或培養(yǎng)皿中（每個(gè)平皿可放置2-3片）； 

3．在距離紫外燈直射范圍內(nèi)20-30 厘米處照射2-3小時(shí)； 

4．將經(jīng)過(guò)計(jì)數(shù)的細(xì)胞懸浮液移入培養(yǎng)板中，使蓋玻片完全浸在培養(yǎng)液中； 

5．將培養(yǎng)板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，當(dāng)貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)板底部2/3面積時(shí)，將培養(yǎng)板取出，用蓋片鑷輕輕取出蓋玻片，用蒸餾水漂洗后即可進(jìn)行快速固定以及細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)。 

細(xì)胞培養(yǎng)方法：

1、細(xì)胞傳代：細(xì)胞密度達(dá)到80-90%時(shí)即可傳代

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%胰酶（T25瓶），使胰酶覆蓋整個(gè)瓶或皿，蓋好放入培養(yǎng)箱消化；

③1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，若大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入完全培養(yǎng)基終止消化；若細(xì)胞還是貼壁，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)消化至可以輕輕吹打下為止；

④將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清；

⑤用新鮮培養(yǎng)基重懸后加入培養(yǎng)瓶或皿中，T25培養(yǎng)瓶加6-8ml培養(yǎng)基；

⑥懸浮細(xì)胞直接離心收集，細(xì)胞沉淀重懸后分到新培養(yǎng)瓶中。

2、細(xì)胞復(fù)蘇：

①將凍存管在37℃溫水中快速搖晃融化，時(shí)間1min左右，加入4-5ml培養(yǎng)基混勻。

②在1000RPM左右條件下離心4min，棄上清,加1-2ml培養(yǎng)基吹勻，將細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基。

3、細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存保種

①棄去培養(yǎng)上清，用PBS或生理鹽水清洗1-2次，加入1mL 0.25%胰蛋白酶（T25瓶）

②1-2min后，顯微鏡下觀察細(xì)胞，大部分細(xì)胞回縮且有少量細(xì)胞脫落，輕輕吹打下確認(rèn)消化情況后加入完全培養(yǎng)基終止消化；

③將細(xì)胞懸液1000RPM左右條件下離心4min，棄上清，加1ml凍存液重懸細(xì)胞；

④將凍存管放入程序降溫盒，放入-80℃冰箱，4小時(shí)后將凍存管轉(zhuǎn)入液氮罐儲(chǔ)存。

L-Trptophan L-色氨黃芪甲苷順-二雙(三乙基膦)鉑(II)MLC/Myosin light chain 3 peptide  肌球蛋白輕鏈3抗原
L-Trptophan L-色氨黃芪皂苷Ⅰ異煙乙酯MIF (Macrophage Migration Inhibitory Factor)  巨噬移動(dòng)抑制因子抗原
L-Arabinose L-阿拉伯糖黃芪皂苷Ⅱ異煙乙酯MIP-1 Beta (macrophage inflammatory protein 1 Beta)  巨噬炎癥因子1β 抗原
Malt Extract 麥芽提取物黃芪皂苷Ⅲ2-乙基-3-甲基吡CD122/IL-2RB(Imterleukm-2 Receptor beta)  CD122/白介素2受體β鏈抗原
學(xué)(LP0005)丁香酚2-乙基-3-甲基吡MIP2 (myocardial ischemic preconditioning upregulated protein 2)  巨噬炎癥蛋白2抗原
學(xué)明膠 (LP0008)黃楊（環(huán)維黃楊星D）甲基二乙氧基膦MMP-13 (Matrix metalloproteinase 13)  基質(zhì)金屬蛋白酶13抗原
瓊脂（1 號(hào)瓊脂）Agar Bacteriological(Agar )紅景天苷甲基二乙氧基膦MMP-20(matrix metalloproteinase 20)  基質(zhì)金屬蛋白酶20抗原
技術(shù)瓊脂 (3號(hào)瓊脂) (LP0013)rosarin3-氨基-4-羥基苯甲MMP-17(Matrix metalloproteinase-17)  基質(zhì)金屬蛋白酶-17抗原
肝脫水物學(xué)）（Liver Desiccated Bacteriological）絡(luò)塞維3-氨基-4-羥基苯甲MMP-26(Matrix metalloproteinase-26)  基質(zhì)金屬蛋白酶-26抗原
中性肝消化物（Liver Digest Neutralised）rosin3-氨基-4-羥基苯甲MMP-9(matrix metalloproteinase 9)  基質(zhì)金屬蛋白酶-9抗原
高純度瓊脂(Purified Agar)rosiridin4,4'-(1-苯乙基)雙酚MMP-10(matrix metalloproteinase 10)  基質(zhì)金屬蛋白酶-10抗原
Peptone Bacteriological Neutralised 中性**學(xué)蛋白胨槐果4,4'-(1-苯乙基)雙酚MPO peptide  髓過(guò)氧化物酶抗原
Peptone MycologicaL 蛋白胨花旗松素（二氫槲皮素）4,4'-(1-苯乙基)雙酚MRP2 (multidrug resistance-associated protein2)  多藥耐藥相關(guān)蛋白2
Casein Hydrolysate（Acid）/酪蛋白水解物（解) 現(xiàn)貨槲皮素波生坦(水合物)MRP5/ABCC5(Multidrug Resistanec-Associated Protein 5)  多藥耐藥相關(guān)蛋白5抗原
胰蛋白胨T（Tryptone T）槲皮苷2-基乙酯MrpL28 (mitochondrial ribosomal protein L28)  線粒體核糖體蛋白L28(抗原)
中性大豆蛋白胨（Soya Peptone Neutralised）蒿甲順-雙(2,2-二吡基)二化釕(II)二水合物MLH1(Mutl homolog l gene)  錯(cuò)配修復(fù)蛋白1抗原
胰蛋白示（Trytose）姜黃素草鈰(III)水合物, REactonMUC5AC/Mucin 5AC(Gastric Mucin M1)  胃粘液素抗原
乳清蛋白水解物（Lactalbumin Hydrolysate）去甲氧基姜黃素草鈰(III)水合物, REactonMTNR1B/MTNR-1B(Melatonin receptor 1B)  褪黑素受體1B抗原
Peptone P 蛋白胨P雙去氧基姜黃素4-溴鄰苯二胺MLN(Motilin)peptide  胃動(dòng)素多肽
膽鹽(Bile Salts)莪術(shù)(姜黃)4-溴鄰苯二胺mTOR(Mammalian target of rapamycin)  雷帕霉素靶蛋白
3 號(hào)膽鹽(Bile Salts No.3)金絲桃苷5-戊酰Muc-1/CD227  粘蛋白-1/上皮膜
乳糖（用） Lactose Bacteriological金絲桃素5-戊酰MyD88 (myeloid differential protein-88)  髓樣分化蛋白抗原
兔**內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞葡萄糖 (LP0071)絞股藍(lán)皂苷5-戊酰PMP2/FABP8(peripheral myelin protein 2)  周?chē)窠?jīng)髓鞘蛋白2抗原
Peptone Special 特殊蛋白胨苦杏仁苷2-甲基-4-戊烯MYSM1(Myb-like, SWIRM and MPN domain-containing protein 1)  MYSM1抗原

實(shí)驗(yàn)要點(diǎn)及說(shuō)明：

1．本方法適用于貼壁細(xì)胞培養(yǎng)，而不適用于懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，懸浮細(xì)胞可使用滴片法； 

2．所使用的蓋玻片應(yīng)該為玻璃**，并經(jīng)過(guò)鉻酸洗液處理； 

3．蓋玻片非常薄，易碎，取放蓋玻片時(shí)動(dòng)作要輕； 

4．如果需要更多生長(zhǎng)狀態(tài)一致的細(xì)胞，可以使用較大的培養(yǎng)皿，但不宜過(guò)大，以避免培養(yǎng)液的浪費(fèi)和增加污染機(jī)率； 

5．如果細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)能力較差，可將蓋玻片在0.5%多聚賴氨酸溶液中浸泡5-10分鐘并自然晾干。

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