PCR引物設(shè)計(jì)的目的是為了找到一對(duì)合適的核苷酸片段，使其能有效地?cái)U(kuò)增模板DNA序列。引物的優(yōu)劣直接關(guān)系到PCR的特異性與成功與否。引物設(shè)計(jì)基礎(chǔ)如下：

1.引物長(zhǎng)度：教科書要求15-30bp，常用為20bp左右。實(shí)際情況zui 好是18-24bp，以保證特異性，不是越長(zhǎng)越好，太長(zhǎng)的引物同樣會(huì)降低特異性，并且降低產(chǎn)量 。

2.引物擴(kuò)增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴(kuò)增長(zhǎng)至10kb的片段。

3.引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C過(guò)多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC zui好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。5'端和中間序列要多GC，以增加穩(wěn)定性，避免3'端GC rich，zui后3個(gè)堿基不要有GC，或者zui后5個(gè)有3個(gè)不要是GC。

4.避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級(jí)結(jié)構(gòu)，避免兩條引物間互補(bǔ)，特別是3’端的互補(bǔ)，否則會(huì)形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴(kuò)增條帶。

5.引物3’端的堿基，特別是zui末及倒數(shù)第2個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，以避免因末端堿基不配對(duì)而導(dǎo)致PCR失敗。

6.引物中有或能加上合適的酶切位點(diǎn)， 被擴(kuò)增的靶序列zui好有適宜的酶切位點(diǎn)， 這對(duì)酶切分析或分子克隆很有好處。

7.引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)的其它序列無(wú)明顯同源性。

8.學(xué)會(huì)使用軟件：PP5，Oligo6，DNAstar，Vector NTI，primer3（這個(gè)在線設(shè)計(jì)zui好用）。

以上內(nèi)容，至少可以解決99%的引物設(shè)計(jì)問(wèn)題。