TaqMan探針是一種用于實時熒光定量PCR（qPCR）的熒光標(biāo)記寡核苷酸，它由5'端的熒光報告基團(tuán)和3'端的淬滅基團(tuán)組成。TaqMan探針設(shè)計是實時熒光定量PCR（qPCR）中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，其質(zhì)量直接影響實驗的準(zhǔn)確性和靈敏度。以下是主要注意事項：

1、探針基本結(jié)構(gòu)要求：

l ?標(biāo)記基團(tuán)?：5'端標(biāo)記熒光報告基團(tuán)（如FAM、HEX），3'端標(biāo)記淬滅基團(tuán)（如BHQ、TAMRA）?。

l ?長度?：通常為25-35 bp（MGB探針可縮短至13-25 bp），確保特異性結(jié)合。

l ?Tm值?：比引物高5-10℃，推薦65-72℃（MGB探針需額外調(diào)整）。

2、避免二聚體和發(fā)卡結(jié)構(gòu)：

設(shè)計時要避免探針內(nèi)部或探針與引物之間形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)或二聚體，這可能影響探針的結(jié)合效率和特異性。

3、熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)的選擇：

熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的選擇應(yīng)與qPCR儀器兼容，且熒光基團(tuán)的發(fā)射光譜應(yīng)與淬滅基團(tuán)的吸收光譜重疊，確保熒光信號的**檢測。

常用的淬滅基團(tuán)包括BHQ系列、MGB、TAMRA和Eclipse，選擇時需考慮其淬滅效率和光譜特性。

4、序列保守性：

探針必須高度保守，確保目標(biāo)序列的特異性檢測。

選擇GC含量在30-80%之間，避免多個連續(xù)的G堿基，且5’端避免G堿基，因為G可能淬滅熒光。

5、多重qPCR兼容性：

如果需要進(jìn)行多重qPCR，探針應(yīng)使用不同的熒光基團(tuán)，以便區(qū)分不同的靶基因。

其他關(guān)鍵點(diǎn)：

l ?純化要求?：長探針（>50 bp）需純化去除截斷序列。

l ?濃度優(yōu)化?：引物濃度0.1-0.5 μM，探針濃度需通過實驗驗證。

l ?軟件輔助?：推薦使用PrimerExpress等工具綜合評估Tm值、GC含量等參數(shù)。

6、建議與要點(diǎn)回顧：

l 探針設(shè)計前務(wù)必進(jìn)行序列比對，確保特異性；

l 使用專業(yè)軟件（如Primer Express、Oligo）輔助設(shè)計；

l 探針的5’端避免G，GC含量適中，Tm值高于引物；

l 實驗前通過軟件評估探針的二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)風(fēng)險；

l 探針與引物的位置關(guān)系要合理，避免空間位阻。

遵循這些原則可以幫助確保TaqMan探針的有效設(shè)計，從而提高qPCR實驗的準(zhǔn)確性和重復(fù)性。