高效液相色譜儀測定原料乳與乳制品中三聚氰胺含量
1、原理
試樣用三***溶液-乙腈提取，經(jīng)陽離子交換固相萃取柱凈化后，用高效液相色譜儀測定，外標(biāo)法定量。
2、試劑與材料
除非另有說明，所有試劑均為分析純，水為GB/T 6682規(guī)定的上等水。
2.1 甲醇：色譜純。
2.2 乙腈：色譜純。
2.3 氨水：含量為25％～28％。
2.4 三***。
2.5 檸檬酸。
2.6 辛烷磺酸鈉：色譜純。
2.7 甲醇水溶液：準(zhǔn)確量取 50 mL 甲醇和 50 mL 水，混勻后備用。
2.8 三***溶液（1％）：準(zhǔn)確稱取10 g 三***于1 L容量瓶中，用水溶解并定容至刻度，混勻后備用。
2.9 氨化甲醇溶液（5％）：準(zhǔn)確量取 5 mL 氨水和 95 mL 甲醇，混勻后備用。
2.10 離子對(duì)試劑緩沖液：準(zhǔn)確稱取 2.10 g 檸檬酸和 2.16 g 辛烷磺酸鈉，加入約 980 mL 水溶解，調(diào)節(jié) pH 至 3.0 后，定容至 1L 備用。
2.11 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品：CAS 108-78-01，純度大于 99.0%。
2.12 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取 100 mg（準(zhǔn)確到 0.1 mg）三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品于 100 mL 容量瓶中，用甲醇水溶液溶解并定容至刻度，配制成濃度為 1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于 4℃避光保存。
2.13 陽離子交換固相萃取柱：混合型陽離子交換固相萃取柱，基質(zhì)為苯磺酸化的聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物，60 mg，3 mL，或相當(dāng)者。使用前依次用 3 mL 甲醇、5 mL 水活化。
2.14 定性濾紙。
2.15 海砂：化學(xué)純，粒度0.65 mm～0.85 mm，二氧化硅（SiO 2 ）含量為99％。
2.16 微孔濾膜：0.2 μm，有機(jī)相。
2.17 氮?dú)猓杭兌却笥诘扔?99.999％。
3、儀器和設(shè)備
3.1 高效液相色譜儀：配有紫外檢測器。
3.2 分析天平：感量為0.0001 g和0.01 g。
3.3 離心機(jī)：轉(zhuǎn)速不低于 4000 r/min。
3.4 超聲波水浴。
3.5 固相萃取裝置。
3.6 氮?dú)獯蹈蓛x。
3.7 渦旋混合器。
3.8 具塞塑料離心管：50 mL。
3.9 研缽。
4、樣品處理
4.1 提取
4.1.1 液態(tài)奶、奶粉、酸奶、冰淇淋和奶糖等：稱取2 g （準(zhǔn)確至0.01 g）試樣于50 mL具塞塑料離心管中，加入15 mL三***溶液和 5 mL乙腈，超聲提取10 min，再振蕩提取10 min后，以不低于4000 r/min離心10 min。上清液經(jīng)三***溶液潤濕的濾紙過濾后，用三***溶液定容至25 mL，移取5 mL濾液，加入5 mL水混勻后做待凈化液。
4.1.2 奶酪、奶油和巧克力等：稱取2 g（準(zhǔn)確至0.01 g）試樣于研缽中，加入適量海砂（試樣質(zhì)量的4倍～6倍）研磨成干粉狀，轉(zhuǎn)移至50 mL具塞塑料離心管中，用15 mL三***溶液分?jǐn)?shù)次清洗研缽，清洗液轉(zhuǎn)入離心管中 ，再往離心管中加入5 mL乙腈，余下操作同4.1.1中“超聲提取10 min，加入5 mL水混勻后做待凈化液”。
注：若樣品中脂肪含量較高，可以用三***溶液飽和的正己烷液-液分配除脂后再用SPE柱凈化 。
4.2 凈化
將4.1中的待凈化液轉(zhuǎn)移至固相萃取柱中。依次用 3 mL水和3 mL甲醇洗滌，抽至近干 后 ，用6 mL氨化甲醇溶液洗脫。整個(gè)固相萃取過程流速不超過1 mL/min。洗脫液于50℃下用氮?dú)獯蹈?，殘留物（相?dāng)于 0.4 g 樣品）用 1 mL流動(dòng)相定容，渦旋混合1 min ，過微孔濾膜后，供HPLC測定。
5、高效液相色譜儀測定
5.1 高效液相色譜儀參考條件
a) 色譜柱：C 8 柱，250 mm×4.6 mm（i.d.），5 μm，或相當(dāng)者；
C 18 柱，250 mm×4.6 mm（i.d.），5 μm，或相當(dāng)者。
b) 流動(dòng)相：C 8 柱，離子對(duì)試劑緩沖液（3.2.10）-乙腈（85+15，體積比），混勻。
C 18 柱，離子對(duì)試劑緩沖液（3.2.10）-乙腈（90+10，體積比），混勻。
c) 流 速：1.0 mL/min。
d) 柱 溫：40℃。
e) 波 長：240 nm。
f) 進(jìn)樣量：20 μL。
5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
用流動(dòng)相將三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋得到的濃度為 0.8、2、20、40、80 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作液 ，濃度由低到高進(jìn)樣檢測，以峰面積-濃度作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。基質(zhì)匹配加標(biāo)三聚氰胺的樣品。
5.3 定量測定
待測樣液中三聚氰胺的響應(yīng)值應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍內(nèi)，超過線性范圍則應(yīng)稀釋后再進(jìn)樣分析。
5.4 結(jié)果計(jì)算
試樣中三聚氰胺的含量由色譜數(shù)據(jù)處理軟件或按式（1）計(jì)算獲得：
…………………… （1）
式中：
X —— 試樣中三聚氰胺的含量，單位為毫克每千克（mg/kg ）；
A —— 樣液中三聚氰胺的峰面積；
c —— 標(biāo)準(zhǔn)溶液中三聚氰胺的濃度，單位為微克每毫升（μg/mL ）；
V —— 樣液*終定容體積，單位為毫升（mL ）；
A s —— 標(biāo)準(zhǔn)溶液中三聚氰胺的峰面積；
m —— 試樣的質(zhì)量，單位為克（g ）；
f —— 稀釋倍數(shù)。
高效液相色譜儀測定原料乳與乳制品中三聚氰胺含量
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