【原理】

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物雌三醇和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭酶標(biāo)記雌三醇抗體，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物雌三醇的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較可得出相應(yīng)殘留物雌三醇的含量。

【試劑盒技術(shù)指標(biāo)】  

規(guī)       格：96孔/盒

靈 敏 度： 0.05ppb

檢測時間：45min

雌三醇試劑盒樣本定量檢測下限

組織（蝦、魚）…………………………………0.05ppb

豬肉/肝 雞肉/肝 ………………………………… 0.5ppb

飼料………………………………………………… 1ppb

牛奶………………………………………………0.05ppb

樣本回收率

飼  料……………………………………………90±10%

組  織……………………………………………95±10%

牛  奶……………………………………………90±10%

反應(yīng)率

雌三醇………………………………………………100%

【試劑盒組成】  

1、微量測試孔：每條8孔，一板12條

2、標(biāo)準(zhǔn)液×6瓶：（1ml/瓶）0ppb、0.05ppb、 0.15ppb、0.45ppb、1.35ppb、4.05ppb

3、酶標(biāo)抗體工作液   7ml…………………………綠色帽

4、底物液 A液   7ml………………………………棕色帽

5、底物液 B液   7ml……………………………… 黑色帽

6、終 止 液         7ml……………………………… 黃色帽

7、20X濃縮洗滌液  40ml…………………………白色帽

8、2X濃縮復(fù)溶液   50ml…………………………藍(lán)色帽

雌三醇試劑盒【所用儀器、試劑】  

儀器：微孔板酶標(biāo)儀450nm/630nm、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀/氮?dú)獯蹈裳b置、均質(zhì)器、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平（感量0.01g ）

微量移液器：單道 20μl～200μl、100μl～1000μl、多道 250μl

試   劑：乙腈、正己烷、無水硫酸鈉

【實(shí)驗(yàn)前溶液配制】

配液1、將2X濃縮復(fù)溶液用去離子水按照1：1稀釋（1 份濃縮復(fù)溶液+1份去離子水）用于樣本的復(fù)溶。

配液2、將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。

【樣本前處理步驟】  

處理任何樣本時，都必須注意：

（a）實(shí)驗(yàn)中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭。

（b）實(shí)驗(yàn)之前須檢查各種實(shí)驗(yàn)器具是否干凈，必要時可對實(shí)驗(yàn)器具進(jìn)行清潔，以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

（a）飼料樣本

1、      稱取2±0.05g搗粹后的飼料樣本，加入8ml乙腈，振搖5min，15℃，4000r/min以上，離心10min；

2、      取2ml上清液，60℃氮?dú)?空氣吹干；

3、      用1ml正己烷溶解干燥的殘留物，加入1ml稀釋后的復(fù)溶液混合30s；室溫4000r/min以上，離心10min，

不同樣本按如下方法稀釋：

配合料：取50μl，加入450μl稀釋后的復(fù)溶液，渦動混勻30s，取50μl 用于檢測。

濃縮料/預(yù)混料：取50μl，加入950μl稀釋后的復(fù)溶液，渦動混勻30s，取50μl 用于檢測。

配合料稀釋倍數(shù)：20      

濃縮料、預(yù)混料稀釋倍數(shù)：40

（b）組織（雞肉/肝、豬肉/肝、蝦、魚）

1、      稱取2±0.05g勻漿后的樣本，加入1克無水硫酸鈉和6ml乙腈，振搖5min，15℃，4000r/min以上，離心10min。

2、      取3ml上清液，60℃氮?dú)?空氣吹干。

3、      用1ml正己烷溶解殘留物，加入1ml稀釋后的復(fù)溶液混合30s；室溫4000r/min以上，離心5min，

不同樣本按如下方法稀釋：

       蝦魚：直接取50μl下層水相用于檢測。豬肉/肝、雞肉/肝：取50μl下層水相加入450μl稀釋后 的復(fù)溶液，渦動混合30s；取50μl

       用于檢測。

       樣本的稀釋倍數(shù)：

       蝦魚稀釋倍數(shù)：1     

       豬肉/肝、雞肉/肝稀釋倍數(shù)：10

（c）牛奶高檢測限處理方法；

1、      取2ml奶液到離心管中，加入3克無水硫酸鈉，和6ml乙腈，??烈振蕩5min，室溫4000r/min以上，離心10min，直至清亮；

2、      移取3ml上清液至干凈的試管中，60℃氮?dú)?空氣吹干；

3、      用1ml正己烷溶解殘留物，加入1ml稀釋后的復(fù)溶液混合30s；室溫4000r/min以上，離心10min;

4、      取50μl下層水相用于檢測分析。

       樣本的稀釋倍數(shù)：1

（d）牛奶低檢測限處理方法；

1、      直接取50μl牛奶+450μl稀釋后的復(fù)溶液混合30s；

2、      取50μl用于檢測分析。

        樣本稀釋倍數(shù)：10

雌三醇試劑盒【酶標(biāo)**分析程序】  

操作步驟：

1、      從4℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，置室 溫（20-25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

2、      取出框架及需要數(shù)量的微孔，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3、      編號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置

4、      加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本50μl/孔到各自的微孔中，然后加酶標(biāo)抗體50μl/孔，用蓋板膜封板，輕輕振蕩混勻。25℃環(huán)境中反應(yīng)30min。

5、      取出將孔內(nèi)液體甩干，用洗液250μl /孔，洗板4－5次，每次間隔15-30s，用吸水紙拍干（拍干后未被**的氣泡可用干凈的

           槍頭刺破）。

6、      顯色：每孔加入底物液A液50μl， 再加B液50μl，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中避光顯色15min。

7、      測定：每孔加入終止液50μl，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，在5min內(nèi)讀完數(shù)

          據(jù)），測定每孔OD值。

【結(jié)果判定】  

結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與其所含雌三醇成負(fù)相關(guān)。

1、粗略判定

用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)吸光度值比較即可得出其濃度范圍(ppb)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.310， 樣本2的吸光度值為0.820，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：0ppb為1.510;0.05ppb為1.320；0.15ppb為1.030；0.45ppb為0.660； 1.35ppb為0.389；4.05ppb為0.198。則樣本1的濃度范圍是1.35ppb-4.05ppb； 樣本2的濃度范圍是0.15 ppb-0.45 ppb。乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中雌三醇實(shí)際含量。

2、定量分析

（1）百分吸光率的計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以**個標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以100%，即：

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以雌三醇濃度（ng /ml）的半對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中雌三醇實(shí)際含量。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。（歡迎來電索取）  

3、標(biāo)準(zhǔn)曲線

B/B0 (%)

        0.05       0.15        0.45        1.35       4.05

雌三醇(ppb) [μg/kg]

             圖1：雌三醇檢測試劑盒的回歸曲線

4、再現(xiàn)性

%CV

                                 雌三醇(ppb) [μg/kg]

                      圖2：雌三醇檢測試劑盒的精密度

由多個不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定了精密度，圖2顯示出雌三醇檢測試劑盒的精密度情況，獲得的標(biāo)準(zhǔn)吸收值的變異系數(shù)（%CV）對相應(yīng)雌三醇濃度作曲線，可以看到在全部范圍內(nèi)變異系數(shù)如此之低，可以得到很好的再現(xiàn)性。

雌三醇試劑盒【注意事項(xiàng)】  

1、      使用前將所有試劑溫度回升至室溫20-25℃。試劑及標(biāo)本沒有回到室溫（20-25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

2、      在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會伴隨著出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行

           下一步操作。

3、      混合要均勻，否則會出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。

4、      反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。

5、      不要使用過了有效日期的試劑盒，稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值的變化。不要交換使用不同批號的盒中試劑。

6、      不用的微孔板放進(jìn)自封袋密封；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

7、      顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個單位（A_450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質(zhì)。

8、      該試劑盒*佳反應(yīng)溫度為25℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

【儲存】

 原包裝應(yīng)儲存于2～8℃保鮮冷藏，切勿冷凍。

【有效期】

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