【原理】

試劑盒采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物恩諾沙星和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)抗恩諾沙星抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留恩諾沙星的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出相應(yīng)殘留物恩諾沙星的含量。

【試劑盒技術(shù)指標(biāo)】  

規(guī)       格：96孔/盒

靈 敏 度： 0.1ppb

檢測(cè)時(shí)間： 45min

恩諾沙星試劑盒樣本定量檢測(cè)下限： 

組   織………………………………………0.1ppb

蜂   蜜………………………………………0.2ppb

血   清………………………………………0.2ppb

樣本回收率

組   織…………………………………80±15%

血   清…………………………………80±15%

蜂   蜜 ……………………………… 75±15%

恩諾沙星反應(yīng)率

恩諾沙星（ENR）………………………100％

【試劑盒組成】  

1、      微量測(cè)試孔：每條8孔，一板12條

2、      標(biāo)準(zhǔn)液×6瓶：（1ml/瓶） 0ppb、0.1ppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1ppb

3、      酶標(biāo)記物            7ml……………………………紅色帽

4、      酶標(biāo)抗體工作液   7ml……………………………綠色帽

5、      底物A液             7ml……………………………棕色帽

6、      底物B液　      7ml…………………………………黑色帽

7、      終止液           7ml…………………………………黃色帽

8、      20X濃縮洗滌液  40ml ……………………………白色帽

9、      2X濃縮復(fù)溶液   50 ml ……………………………藍(lán)色帽

恩諾沙星試劑盒【所用儀器、試劑】  

具備的儀器：微孔酶標(biāo)儀、打印機(jī)、均質(zhì)器 、氮?dú)獯蹈裳b置、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平（感量0.01g）

微量移液器：?jiǎn)蔚?0μl-200μl、100μl-1000μl，多道250μl

試         劑：濃鹽酸、二氯甲烷、正己烷、乙腈、肝素鈉Na₂HPO₄·12H₂O、NaH₂PO₄·2H₂O、

【實(shí)驗(yàn)前溶液配制】

樣本處理前需配制：

配液1、0.1M HCL溶液860μl濃鹽酸加去離子水100ml溶解。

配液2、乙腈-0.1MHCL溶液V_乙腈：V_0.1M –HCL ＝ 84：16

配液3、乙腈-二氯甲烷混合溶液V_乙腈-V_二氯甲烷  =  1 : 4

配液4、pH7.2  0.05M PB緩沖液12.9gNa₂HPO₄·12H₂O+2.175gNaH₂PO₄·2H₂O加去離子水1L溶解。

配液5、pH7.2   0.02MPB緩沖液 5.16gNa₂HPO₄·12H₂O+0.87gNaH₂PO₄·2H₂O加去離子水1L溶解。

配液6、用去離子水將2X濃縮復(fù)溶液按1：1稀釋（1份濃縮復(fù)溶液+1份去離子水）用于樣本復(fù)溶。

配液7、將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。

【樣本前處理方法】  

樣本前處理須知

處理任何樣本時(shí)，都必須注意：

（a）本試劑盒所檢測(cè)的組織樣本包括：動(dòng)物組織、禽類和水產(chǎn)組織。eg:雞、鴨、牛、兔、魚、蝦等。

（b）實(shí)驗(yàn)中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時(shí)要更換吸頭。

（c）實(shí)驗(yàn)之前須檢查各種實(shí)驗(yàn)器具是否干凈，必要時(shí)可對(duì)實(shí)驗(yàn)器具進(jìn)行清潔，以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

恩諾沙星試劑盒樣本前處理步驟

（a）組織樣本（雞肉/肝、豬肉/肝、蝦、魚等）

1、 稱2.0±0.05g 均質(zhì)的組織樣本于50ml離心管中；

2、 加入乙腈-二氯甲烷混合溶液8ml，振蕩5min，4000r/min以上，15℃離心10min；

3、 取4ml上層清澈有機(jī)相至干燥溶器中，56℃氮?dú)獯蹈?旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干；

4、 用1ml稀釋后的復(fù)溶液溶解干燥的殘留物，加入正己烷1ml混合30s，4000r/min以上，15℃離心5min；

5、 去除上層取下層50μl液體用于分析。

         樣本稀釋倍數(shù)：1

（b）血清樣本的處理

1、用加有肝素鈉（20-30單位/ml血）的離心管采集血樣本（建議采血注射器也用肝素鈉潤(rùn)洗），血樣本室溫靜置1h，待析出血漿

    后4000r/min以上，15℃離心10min，取出血漿1ml；

2、加入乙腈（無水）4ml上下充分混合5min，4000r/min以上，15℃離心10min；

3、移上清至另一離心管中，加入2ml 0.02M PB緩沖液，混勻；

4、加入二氯甲烷5ml，充分混勻5min，4000r/min，15℃離心10min，去上層，取下層有機(jī)相到干燥瓶中（清亮無雜質(zhì)），50℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干/氮?dú)獯蹈桑?/span>

5、用1ml稀釋后的復(fù)溶液溶解干燥的殘留物，加入正己烷1ml混合30s，4000r/min以上，離心5min；

6、輕吸掉上層和中間白色雜質(zhì)，取下層相100μl加入100μl稀釋后的復(fù)溶液，混合30s；

7、取50μl用于分析。

        樣本稀釋倍數(shù)：2

（c）蜂蜜

1、取1g蜂蜜，加６ml乙腈-0.1MHCL溶液振蕩至蜂蜜全部溶解；

2、加入３ml 0.05M PB緩沖液，加入11ml二氯甲烷，振蕩5min，4000r/min以上離心5min；

3、輕吸掉上層，取下層有機(jī)相８ml至干燥溶器中，56℃氮?dú)獯蹈桑?

4、用1ml稀釋后的復(fù)溶液溶解干燥的殘留物，再加入正己烷1ml混合30s，3000r/min以上，15℃離心5min；

5、去除上層取下層50μl液體用于分析。

        稀釋倍數(shù)：2

注：在使用國(guó)家規(guī)定*高殘留限量（100ppb）進(jìn)行判定時(shí)，需進(jìn)行10倍稀釋（1份樣本液+9份已稀釋好的復(fù)溶液）。

恩諾沙星試劑盒【酶標(biāo)**分析程序】  

操作步驟：

1、將試劑盒從冷藏環(huán)境中取出并將所需試劑從試劑盒取出，置室溫（20-25℃）平衡30min以上, 注意每種液體試劑使用前均須搖

     勻。

2、按需要取出微孔條及板架，將不用的微孔板重新密封，保存于2-8℃，不要冷凍。

3、編號(hào)：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品均需做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔的樣本孔所在的位置。

4、加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50μl /孔，然后加入50μl/孔酶標(biāo)記物；再加入50μl/孔抗體工作液。輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板，25℃環(huán)境反應(yīng)

     30min。

5、取出用洗滌液按每孔250μl洗板4-5次，每次浸泡15-30秒，拍干（拍干后未被**的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

6、顯色：每孔加入底物液A液50μl再加B液50μl，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境避光顯色15min。

7、測(cè)定：每孔加入終止液50μl，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長(zhǎng)450/630nm檢測(cè)在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），測(cè)

     定吸光度值（OD值）。

【結(jié)果判定】  

結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與恩諾沙星的含量成負(fù)相關(guān)。

1、粗略判定

用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)品比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.238， 樣本2的吸光度值為0.946，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：0ppb為1.845； 0.1ppb為1.542；0.3ppb為1.130； 0.9ppb為0.635；2.7ppb為0.326； 8.1ppb為0.156。則樣本1的濃度范圍是2.7ppb-8.1ppb；樣本2的濃度范圍是0.3ppb-0.9ppb。乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中恩諾沙星的實(shí)際濃度。

2、定量分析

（1）百分吸光率的計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以**個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以100%，即

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng/ml）的半對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中恩諾沙星的實(shí)際濃度。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。（歡迎來電索?。?

3、標(biāo)準(zhǔn)曲線：

B/B0 (%)

             0.1              0.3             0.9             2.7            8.1

 (ppb) [μg/kg]

圖1：恩諾沙星檢測(cè)試劑盒的回歸曲線

4、再現(xiàn)性：

%CV

      0        0.1    0.3      0.9     2.7    8.1

(ppb) [μg/kg]

圖2：恩諾沙星檢測(cè)試劑盒的精密度

由多個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定了精密度，圖2顯示出恩諾沙星檢測(cè)試劑盒的精密度情況，獲得的標(biāo)準(zhǔn)吸收值的變異系數(shù)（%CV）對(duì)相應(yīng)恩諾沙星濃度作曲線，可以看到在全部范圍內(nèi)變異系數(shù)如此之低，可以得到很好的再現(xiàn)性。

【注意事項(xiàng)】  

1、使用前將所有試劑溫度回升至室溫20-25℃。試劑及標(biāo)本沒有回到室溫（20-25℃）會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

2、在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會(huì)伴隨著出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一

    步操作。

3、混合要均勻，否則會(huì)出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。

4、反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。

5、不要使用過了有效日期的試劑盒，稀釋或攙雜使用會(huì)引起靈敏度、OD值的變化。不要交換使用不同批號(hào)的盒中試劑。

6、不用的微孔板放進(jìn)自封袋密封；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對(duì)光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

7、顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個(gè)單位（A_450nm< 0.5 ）時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。

8、該試劑盒*佳反應(yīng)溫度為25℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測(cè)吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

【儲(chǔ)存】

 原包裝應(yīng)儲(chǔ)存于2～8℃保鮮冷藏，切勿冷凍。

【有效期】

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