【產(chǎn)品簡介】

克倫特羅屬于β-興奮劑類**，俗稱瘦肉精，可提高胴體瘦肉率，曾被廣泛添加于飼料中。人食用了含克倫特羅殘留的動物性食品，會出現(xiàn)肌肉震顫、心悸、過敏、**、目眩、惡心、嘔吐、發(fā)燒、顫栗等癥狀，世界各國已明文禁止其使用。常規(guī)儀器檢測方法不能滿足實際生產(chǎn)中大批量檢測的需求。鹽酸克倫特羅快速檢測試劑盒具有方便、快速、靈敏等特點，適用于大批量樣品快速檢測。

鹽酸克倫特羅試劑盒【測定原理】

本試劑盒采用間接競爭ELISA法檢測尿樣和組織等樣本中的克倫特羅，在微孔條上預包被偶聯(lián)抗原，利用抗原與抗體的特異性**化學反應(yīng)的原理來進行，樣本中的克倫特羅和微孔條上預包被偶聯(lián)抗原競爭標記有辣根過氧化酶的抗克倫特羅抗體，通過洗滌后，用TMB底物顯色，樣品中的克倫特羅含量與樣品的吸光度值呈反比，與標準曲線比較即可得出克倫特羅含量。

【試劑盒技術(shù)指標】  

規(guī)      格：96孔/盒

靈 敏 度： 0.1ppb

檢測時間： 45min

樣本檢測下限：

尿     樣  …………………………………   0.1ppb

組    織（處理法一）……………………  0.4ppb

組    織（處理法二）……………………  0.1ppb

飼    料  …… ……………………………   1 ppb

鹽酸克倫特羅試劑盒交叉反應(yīng)率：

克倫特羅（Clenbuterol）…………………    100%

特普他林（Terbutalin）……………………   <0.1%

馬布特羅(Mabuterol)  ………………………  <0.1%

溴布特羅(Brombuterol)  ……………………  <0.1%

沙丁胺醇（Salbutamol ）…………………     <0.1%

萊克多巴胺（Ractopamine）………………   <0.1%

樣本回收率：

尿     樣   ……………………… 95%±10%

組     織   ……………………… 85%±15%

飼     料   ……………………… 85%±15%

【試劑盒組成】

1、      微量測試孔：1×96孔板（12條×8孔）

2、      （Clenbuterol標準溶液X6瓶：（1ml/瓶）0ppb、0.1ppb、0.3ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1ppb

3、      酶標記抗體工作液 10ml………………綠色帽

4、      底物A液     7ml  ……………………白色帽

5、      底物B液     7ml  ……………………黑色帽

6、      終  止  液     7ml  ……………………黃色帽

7、      20X濃縮洗滌液40 ml  ………………透明帽

鹽酸克倫特羅試劑盒【 所用儀器、試劑】

具備的儀器：微孔酶標儀、氮氣吹干裝置、打印機、均質(zhì)器 、振蕩器、離心機、恒溫箱、天平（感量0.01g）、刻度移液管

微量移液器：單道20μl-200μl、100μl-1000μl、多道250μl

試         劑：氫氧化鈉、乙酸乙酯、濃HCl、乙腈、甲醇、正己烷、無水硫酸鈉

【實驗前溶液配制】

配液1、0.1M HCl 溶液        取0.86ml濃HCl加水定溶至100ml。

配液2、0.1M NaOH 溶液    稱取0.4g NaOH加水定溶至100ml。

配液3、乙腈-0.1M HCl 溶液          V_乙腈：V_HCl =84：16

配液4、將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。

（a）尿樣本的處理方法

取20μl清亮尿樣直接測定（如果尿樣渾濁一定要過濾或離心10min，4000r/min，直至得到清亮尿樣），暫不使用的樣本應(yīng)冷凍保存。

樣本稀釋倍數(shù)：1

（b）組織樣本的處理方法一

1、稱2±0.05g組織，加入6ml去離子水，充分振蕩2min，室溫4000r/min以上離心10min(注：若組織樣本中油脂含量較高，可在振

     蕩后放入85℃水浴10min后再離心)。

2、 取20μl上清液進行分析。

樣本稀釋倍數(shù)：4

（c）組織樣本的處理方法二

1、稱取 2 ± 0.05g 的組織， 加入6ml乙腈-0.1MHCl，振蕩2min,室溫4000r/min以上離心10min。

2、取上清3ml，加入2ml 0.1M NaOH，加入6ml乙酸乙酯，振蕩1min，室溫4000r/min 以上離心10min。取全部上清于50℃氮

     氣或空氣吹干。

3、加入1ml三蒸水復溶，混合30s，取20μl進行分析。

樣本稀釋倍數(shù)：1

（d）飼料樣品的處理方法

1.  稱1.0±0.05g研碎的飼料樣品，加入10ml甲醇，再加入5g無水硫酸鈉，放振蕩器上振蕩2min；15℃ 4000r/min以上離心10min；

2.  吸出離心后的上清液1ml，于56℃氮氣吹干，用1 ml  去離子水溶解干燥的殘留物，再加入1mL正己烷混合30s ；15℃ 4000r/min以上離心5min。

3.  取20μl下層進行分析。

樣本稀釋倍數(shù)：10

【酶標**分析程序】

1、將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置室溫（20-25℃）平衡30min以上, 注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

2、按需要取出微孔條及板架，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3、編號：將樣本和標準品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣品和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。

4、加標準品/樣本20μl/孔到各自的微孔中，然后加入80μl/孔的酶標記抗體工作液，用蓋板膜蓋板，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境反應(yīng)30min 。

5、取出微孔板，甩出孔內(nèi)液體，用配制好的洗滌液按250μl /孔洗板4-5次，每次浸泡15-30秒，用吸水紙拍干.

6、顯色：每孔先加入底物液A液50μl，再加底物B液50μl，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中避光顯色15min。

7、測定：每孔加入終止液50μl，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），測定吸光度值（OD值）。

鹽酸克倫特羅試劑盒【結(jié)果判定】

  結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與其所含克倫特羅的含量成負相關(guān)。

1、粗略判定：

用樣品的平均吸光度值與標準值比較即可得出樣本所含克倫特羅濃度范圍（ng/ml）。假設(shè)樣品1的吸光度值為0.313，樣品2的吸光度值為1.032，標準液吸光度值分別是：0ppb為1.892；0.1ppb為1.501；0.3ppb為1.175； 0.9ppb為0.751；2.7ppb為0.421； 8.1ppb為0.198。則樣品1的濃度范圍是2.7ppb-8.1ppb；樣品2的濃度范圍是0.3ppb-0.9ppb。乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中克倫特羅實際濃度。             

2、定量分析：

所獲得的每個濃度標準溶液和樣本吸光度值的平均值（B）除以**個標準（0標準）的吸光度值（B₀）再乘以100%，即百分吸光度值。

B—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標準溶液的平均吸光度值

以標準品百分吸光率為縱坐標，以克倫特羅標準品濃度（ng/ml）的半對數(shù)為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中克倫特羅實際濃度。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣品的準確、快速分析。

3、標準曲線：

B/B0 (%)

 0.1           0.3              0.9               2.7            8.1

    克倫特羅(ppb) [μg/kg]

圖1：克倫特羅檢測試劑盒的回歸曲線

4、再現(xiàn)性：

%C V 

             克倫特羅(ppb) [μg/kg]

圖2：克倫特羅檢測試劑盒的精密度

由多個不同的實驗結(jié)果確定了精密度，圖2顯示出克倫特羅檢測試劑盒的精密度情況，獲得的標準吸收值的變異系數(shù)（%CV）對相應(yīng)克倫特羅濃度作曲線，可以看到在全部范圍內(nèi)變異系數(shù)如此之低，可以得到很好的再現(xiàn)性。

【注意事項】

1、使用前將所有試劑溫度回升至室溫20-25℃。試劑及標本沒有回到室溫（20-25℃）會導致所有標準的OD值偏低。

2、在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會伴隨著出現(xiàn)標準曲線不成線性，重復性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進行下一步操作。

3、混合要均勻，否則會出現(xiàn)重復性不好的現(xiàn)象。

4、反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。

5、不要使用過了有效日期的試劑盒，稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值的變化。不要交換使用不同批號的盒中試劑。

6、不用的微孔板放進自封袋密封；標準物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

7、顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當棄之。0標準的吸光度值小于0.5個單位（A_450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質(zhì)。

8、該試劑盒*佳反應(yīng)溫度為25℃，溫度過???或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

【儲存】

 原包裝應(yīng)儲存于2～8℃保鮮冷藏，切勿冷凍。

【有效期】

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