組織和細胞活性蛋白怎樣提取

一、 試劑盒說明

本試劑盒用于從哺乳動物組織和培養(yǎng)細胞中提取具有活性的全蛋白， 用含有蛋白酶抑制劑及磷酸酶抑制劑的裂解緩沖液

Lysis Buffer 勻漿裂解組織或細胞，作用溫和，提取過程簡便高效。獲得的全蛋白可用于 Western Blot、**共沉淀和酶 的活性的測定的等后續(xù)研究，但不能用于蛋白激酶及磷酸酶**共沉淀的研究，因本試劑盒中包括這兩種酶的抑制劑。 應用方面：可用于 Western Blot、**共沉淀和酶活性測定等后續(xù)研究.

二、試劑盒組份

組份

KGP1050

50 tests

KGP10100

100 tests

儲存溫度

Lysis Buffer

50mL

100mL

2-8℃

磷酸酶抑制劑

500μL

1000μL

-20℃

蛋白酶抑制劑

50μL

100μL

PMSF（100mM）

500μL

1000μL

-20℃，避光

三、操作步驟

Ⅰ 實體組織蛋白的提取

1． 在每 mL 冷 Lysis Buffer 加入 10 μL 磷酸酶抑制劑，1 μL 蛋白酶抑制劑和 10μL PMSF，混勻。冰上保存數(shù)分鐘待 用。

2．  每 100mg 固體組織置于培養(yǎng)皿中，手術(shù)剪剪碎成 3mm×3mm 左右的小塊，加入 0.5～1 mL 冷 Lysis Buffer，玻 璃勻漿器上下手動勻漿 15 次，注意低溫操作；

3． 取組織勻漿液轉(zhuǎn)移到 1.5mL 預冷的離心管，離心 10000 轉(zhuǎn)/分，4℃離心 5 min；

4．  取上清轉(zhuǎn)移至新的預冷的離心管中，即為全蛋白提取物，蛋白定量（Bradford 法、BCA 法）；

5． 分裝保存于-70℃,避免反復凍融。

Ⅱ    培養(yǎng)細胞蛋白提取

1． 貼壁培養(yǎng)的細胞，吸去培養(yǎng)基后，加入 10mL/150mm 培養(yǎng)板的冷 PBS 洗兩次，每次振搖數(shù)次以盡量去除培養(yǎng)液；

2．  懸浮培養(yǎng)的細胞或用細胞刮子刮下的貼壁細胞，將細胞及培養(yǎng)液移至離心管中，1000 轉(zhuǎn)/分離心 10 min，再用

10mL/150mm 培養(yǎng)板的冷 PBS，1000 轉(zhuǎn)/分離心 5 min 洗兩次；

3．  在每 mL 冷 Lysis Buffer 加入 10μL 磷酸酶抑制劑，1μL 蛋白酶抑制劑和 10μL PMSF（用???自配：濃度 100mM， 溶于異丙醇），混勻。冰上保存數(shù)分鐘待用。

4． 在上述培養(yǎng)板或離心管的細胞中，加入上述配制好的冷 Lysis Buffer，加入量如下表所示：

細胞數(shù)量

Lysis Buffer 加入量

107 個

0.5 mL～1 mL

5×106 個

0.2 mL～0.5 mL

5．冷室或冰上操作，貼壁細胞用細胞刮子刮下，皆 Lysis Buffer 一同轉(zhuǎn)移至新的預冷的離心管中；懸浮培養(yǎng)或裂解

前刮下的貼壁細胞皆 Lysis Buffer 一同轉(zhuǎn)移至新的預冷的離心管中，

6．置于 4℃搖床平臺上，溫和振蕩 15 min；

7． 14,000rpm，4℃離心 15min，取上清為全蛋白提取物, 蛋白定量（Bradford 法、BCA 法）；

8．  分裝保存于-70℃,避免反復凍融。

四、注意事項

?      所有接觸樣品的用具及試劑均需預冷。

?      提取蛋白后，如有必要，可透析除去表面活性劑