293轉(zhuǎn)染沒(méi)有表達(dá)熒光經(jīng)驗(yàn)交流

xuwenpku：用pTRACER轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，約70-80%匯合度，3μl lipo，2μg質(zhì)粒，36h后沒(méi)有表達(dá)熒光，請(qǐng)教可能是什么原因?另外，想問(wèn)是不是lipofectamine轉(zhuǎn)染，要求細(xì)胞必須是傳代之后24小時(shí)以?xún)?nèi)的細(xì)胞?延長(zhǎng)轉(zhuǎn)染時(shí)間是否會(huì)有好處呢?

在另外，pTRAceR這個(gè)質(zhì)粒由那位同學(xué)用過(guò)么?它的熒光表達(dá)好不好?

guoguo1984428認(rèn)為：

你可以用PEgfp系列轉(zhuǎn)染試試，這些載體很不錯(cuò)的，還有你的293細(xì)胞代數(shù)是否太高啦?

huli317認(rèn)為：

質(zhì)粒我是沒(méi)用過(guò)，但用293來(lái)包裝擴(kuò)增腺病毒，一般細(xì)胞傳代后13~16小時(shí)就開(kāi)始加病毒液，GFP穩(wěn)定表達(dá)一般要等48小時(shí)，我一般是等72小時(shí)收集病毒，感染目的細(xì)胞也是細(xì)胞傳代后16~20小時(shí)開(kāi)始加病毒液，48小時(shí)后觀(guān)察。雖說(shuō)GFP穩(wěn)定表達(dá)要在48小時(shí)候，但36小時(shí)還沒(méi)看到熒光的話(huà)可能是轉(zhuǎn)染不成功。

gexiaohu認(rèn)為：

3μllipo可能太少了吧。我給樓主一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，每平方厘米的面積用1μl lipo 與1μl質(zhì)粒。放置24小時(shí)。做實(shí)驗(yàn)不要省錢(qián)。多做幾次不成功還不如一次成功哦。另：p-track-cmv這個(gè)質(zhì)粒的熒光效果相當(dāng)好。我做的話(huà)，轉(zhuǎn)染效率基本是60%以上的熒光(24小時(shí))。至于傳代的問(wèn)題，根據(jù)我的經(jīng)驗(yàn)，我通常是養(yǎng)好足量的細(xì)胞，然后胰酶消化，大量接種到6孔板中。一般25cm的falsk 95%融合度的細(xì)胞接種一塊6-well plate。4小時(shí)后會(huì)完全貼壁，這個(gè)時(shí)候馬上做轉(zhuǎn)染，效果不錯(cuò)。個(gè)人的經(jīng)驗(yàn)，見(jiàn)笑!

wangqiang007：

我一般轉(zhuǎn)染液用Vigofect

jzygood認(rèn)為：

各位大俠，也有同樣的問(wèn)題，我用pad tracke-cmv 和adeasy-1系統(tǒng)重組腺病毒，重組后的腺病毒ad-目的基因經(jīng)過(guò)PAC I 酶切用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，包裝重組體腺病毒，在轉(zhuǎn)染前，我對(duì)Pac I酶切ad-目的基因證明是正確的(一條為30KB，一條為4.5KB)，可是我轉(zhuǎn)染過(guò)程中，每次在24h觀(guān)察轉(zhuǎn)染效率很高，即有很多綠色熒光表達(dá)，但是隨著時(shí)間的推移，熒光越練越少，細(xì)胞也沒(méi)出現(xiàn)細(xì)胞病變現(xiàn)象，到12d-14天準(zhǔn)備收毒時(shí)，已經(jīng)沒(méi)有熒光了，我曾想到是沒(méi)有對(duì)PAC I 酶后的ad-目的基因純化，但是仍然不能避免。一位老師說(shuō)有可能是padtrack-cmv上一個(gè)表達(dá)信號(hào)出了問(wèn)題，建議我重新用另一實(shí)驗(yàn)室的padtrack-cnv和ADEASY-1同源重組，請(qǐng)問(wèn)大俠們，我的問(wèn)題出在那里?為什么只能瞬時(shí)表達(dá)，而不能穩(wěn)定表達(dá)??我需要重做么?是我收毒晚么?但是沒(méi)有細(xì)胞病變啊!感激涕零多謝指教!