操作流程:
1.從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
2.設(shè)置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；
3.樣本孔中加入待測樣本50μL；空白孔不加。
4.除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
5.棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次（也可用洗板機洗板）。
6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7.每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值。
產(chǎn)品特點：
1、公司產(chǎn)品僅用于科研不需要單獨純化線粒體，柱式法純化，操作簡單快捷。
2、得到的mtDNA可以直接用于PCR和酶切。
3、每107個動物細胞一般能得到100ng左右的mtDNA，每克組織一般能得到3～5μg mtDNA。
注意：本產(chǎn)品只適合于動物材料，不適合于植物材料，因為植物線粒體DNA一般都十分巨大,非常難提。
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產(chǎn)品名稱
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人多瘤病毒7 PCR試劑盒
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規(guī)格
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50次
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貨號
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FS-01P98985
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產(chǎn)品組成:
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成分
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規(guī)格
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溶液A
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13ml
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溶液B
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13ml
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溶液C
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18ml
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離心吸附柱
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50套
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通用洗柱液
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50ml
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DNA洗脫液
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10ml
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說明書
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1份
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使用方法:
一:培養(yǎng)細胞預處理
1. 用自備的0.25%胰酶消化液處理約107個培養(yǎng)細胞,離心收集后棄上清。
2. 用PBS或TBS等緩沖液洗滌細胞兩次,離心得到的細胞沉淀直接用于mtDNA提取。
二:組織細胞預處理
3. 用剪刀將1g新鮮的動物組織剪碎(芝麻大小*),轉(zhuǎn)移到1.5mL塑料離心管中,用于mtDNA提取。注意:*不要使用凍存的動物組織,因為凍凝過程中形成的冰晶會將線粒體刺破,使其DNA釋放出來被胞漿中的DNA酶降解,影響回收率。
三:血液預處理
4. 將3-5mL抗凝外周血靜置30分鐘或低速離心5分鐘,取白細胞層。
5. 用自備PBS洗滌白細胞兩次,得到的白細胞沉淀用于mtDNA提取。
柱式動物線粒體DNA提取試劑盒(PCR級)四:mtDNA提取
5.在細胞沉淀或剪碎的組織中加入250μL冰浴的溶液A,充分吹打分散。如果是剪碎的組織,不要等成塊的組織溶解即可繼續(xù)下步操作。
6. 加入250μL常溫的溶液B(如果溶液B有沉淀,用前須37℃加熱溶解后冷卻到室溫方可使用),溫和反復顛倒混勻10次。千萬不要劇烈振蕩。
7. 冰上放置6-8分鐘。注意不要超過8分鐘。
8. 加入350μL冰浴的溶液C,溫和混勻4-6次,可見白色沉淀物產(chǎn)生,然后放冰上放置20-25分鐘。
9.室溫12000~15000g離心10分鐘,小心將上清液轉(zhuǎn)移到離心吸附柱中。由于此時的溶液比重較大,有時候出現(xiàn)沉淀漂浮是正?，F(xiàn)象,取上清時避開漂浮的沉淀即可。
10. 靜置5分鐘以讓DNA與離心吸附柱充分結(jié)合,此步十分重要。
11.室溫12000~15000g離心1分鐘,棄收集管中的廢液。
12. 加入500μL的通用洗柱液,室溫12000~15000g離心1分鐘,棄收集管中廢液。
注意:通用洗柱液中含乙醇,用后需要將蓋擰緊存放,否則乙醇會揮發(fā)。
13. 重復上步1次。
14.室溫12000~15000g離心1分鐘,甩干殘留液體。此步不能省略,否則殘留乙醇會影響DNA的后續(xù)使用(如DNA上樣時不能沉淀到加樣孔中)。
15. 將離心吸附柱置于一個新的1.5mL塑料離心管中,加入30-50μL 65-80℃預熱的DNA洗脫液,室溫放置2分鐘。常溫的DNA洗脫液也可以用于洗脫,但產(chǎn)量稍微有所降低。
16.室溫12000~15000g離心1分鐘,離心管底溶液即mtDNA。
17. 由于本公司離心吸附柱結(jié)合DNA能力較強,如果再加30-50μL DNA洗脫液到離心吸附柱中,往往還能洗脫下很多mtDNA(相當于次洗脫的20-30%),但注意不要使用上步得到的mtDNA溶液來洗脫。
18. 12000~15000g離心1分鐘,離心管底溶液即線粒體DNA。每107個動物細胞一般能得到100ng左右的mtDNA,每克組織一般能得到3-5μg mtDNA。如果DNA需要濃縮,可以使用本公司的核酸濃縮劑。
19. 由于DNA機械斷裂,電泳時DNA可能不呈現(xiàn)專一的帶,但此mtDNA溶液可以直接用于PCR。下列是公司正熱銷的產(chǎn)品：
植物游離吲哚-3-乙酸（IAA）比色法定量檢測試劑盒（包括萃取）20次蘆筍
植物結(jié)合吲哚-3-乙酸（IAA）比色法定量檢測試劑盒（包括萃?。?0次葡醛酸鈉
植物彌散吲哚-3-乙酸（IAA）比色法定量檢測試劑盒（包括萃?。?0次非那雄
菊花組織培養(yǎng)試劑專題3-磷酸甘油醛脫氫酶
名稱規(guī)格磷酸甘油醛脫氫酶（小鼠來源）IHC WB
菊花生根（rhizogenesis）完全培養(yǎng)基500毫升溶液/片劑多藥耐藥相關(guān)蛋白3抗體流式組化
菊花愈傷組織再生（callogenesis）完全培養(yǎng)基500毫升溶液/片劑L-苯丙氨酸
菊花生芽（caulogenesis）完全培養(yǎng)基500毫升溶液/片劑N-乙酰-DL-絲氨酸
菊花組織凍存試劑盒50毫升硫酸-5-羥色肌酐
蘭花組織培養(yǎng)試劑專題2-（7-偶氮苯并三氮唑）-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯
名稱規(guī)格蝸牛酶
氣生蘭（epiphytic）播種增殖培養(yǎng)基500毫升溶液/片劑氧化酶
氣生蘭（epiphytic）移植維護培養(yǎng)基500毫升溶液/片劑胰凝乳蛋白酶原
氣生蘭（epiphytic）克隆增殖培養(yǎng)基500毫升溶液/片劑蘋果酸脫氫酶
地生蘭（terrestrial）播種培養(yǎng)基500毫升溶液/片劑SDS-PAGE蛋白質(zhì)次高分子標準
人多瘤病毒7 PCR試劑盒CD55/DAF/FITC 熒光素標記衰變加速因子CD55抗體IgG4-羧基-3-氯苯酸 97%
CD56/FITC 熒光素標記CD56抗體IgG3-氯-5-氟苯酸 95%
CD56/NCAM1/FITC 熒光素標記神經(jīng)粘附分子1抗體IgG4-羧基-3-氟苯酸 98%
CD57/FITC 熒光素標記抗CD57抗體IgG4-氯-2-(三氟甲基)苯酸 97%
CD58/LFA-3/FITC 熒光素標記功能相關(guān)抗原-3抗體IgG4-氯-3-三氟酸 79%
CD59/FITC 熒光素標記反應(yīng)性溶血膜抑制蛋白抗體IgG5-氯-2-酸 97%
CD62L/FITC 熒光素標記L選擇素抗體IgG2-氯-吡啶-4-酸頻哪酯 98%
CD63/MLA1 /FITC 熒光素標記抗溶酶體膜糖蛋白抗體IgG5-氯吡啶-3-酸 95%
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