操作流程:
1.從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
2.設置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；
3.樣本孔中加入待測樣本50μL；空白孔不加。
4.除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
5.棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復洗板5次（也可用洗板機洗板）。
6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7.每孔加入終止液50μL，15min內，在450nm波長處測定各孔的OD值。
產品特點：
1、公司產品僅用于科研不需要單獨純化線粒體，柱式法純化，操作簡單快捷。
2、得到的mtDNA可以直接用于PCR和酶切。
3、每107個動物細胞一般能得到100ng左右的mtDNA，每克組織一般能得到3～5μg mtDNA。
注意：本產品只適合于動物材料，不適合于植物材料，因為植物線粒體DNA一般都十分巨大,非常難提。
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產品名稱
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人類內源性逆轉錄病毒W家族RT-PCR試劑盒
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規(guī)格
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50次
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貨號
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FS-01P98957
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產品組成:
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成分
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規(guī)格
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溶液A
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13ml
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溶液B
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13ml
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溶液C
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18ml
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離心吸附柱
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50套
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通用洗柱液
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50ml
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DNA洗脫液
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10ml
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說明書
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1份
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使用方法:
一:培養(yǎng)細胞預處理
1. 用自備的0.25%胰酶消化液處理約107個培養(yǎng)細胞,離心收集后棄上清。
2. 用PBS或TBS等緩沖液洗滌細胞兩次,離心得到的細胞沉淀直接用于mtDNA提取。
二:組織細胞預處理
3. 用剪刀將1g新鮮的動物組織剪碎(芝麻大小*),轉移到1.5mL塑料離心管中,用于mtDNA提取。注意:*不要使用凍存的動物組織,因為凍凝過程中形成的冰晶會將線粒體刺破,使其DNA釋放出來被胞漿中的DNA酶降解,影響回收率。
三:血液預處理
4. 將3-5mL抗凝外周血靜置30分鐘或低速離心5分鐘,取白細胞層。
5. 用自備PBS洗滌白細胞兩次,得到的白細胞沉淀用于mtDNA提取。
柱式動物線粒體DNA提取試劑盒(PCR級)四:mtDNA提取
5.在細胞沉淀或剪碎的組織中加入250μL冰浴的溶液A,充分吹打分散。如果是剪碎的組織,不要等成塊的組織溶解即可繼續(xù)下步操作。
6. 加入250μL常溫的溶液B(如果溶液B有沉淀,用前須37℃加熱溶解后冷卻到室溫方可使用),溫和反復顛倒混勻10次。千萬不要劇烈振蕩。
7. 冰上放置6-8分鐘。注意不要超過8分鐘。
8. 加入350μL冰浴的溶液C,溫和混勻4-6次,可見白色沉淀物產生,然后放冰上放置20-25分鐘。
9.室溫12000~15000g離心10分鐘,小心將上清液轉移到離心吸附柱中。由于此時的溶液比重較大,有時候出現(xiàn)沉淀漂浮是正常現(xiàn)象,取上清時避開漂浮的沉淀即可。
10. 靜置5分鐘以讓DNA與離心吸附柱充分結合,此步十分重要。
11.室溫12000~15000g離心1分鐘,棄收集管中的廢液。
12. 加入500μL的通用洗柱液,室溫12000~15000g離心1分鐘,棄收集管中廢液。
注意:通用洗柱液中含乙醇,用后需要將蓋擰緊存放,否則乙醇會揮發(fā)。
13. 重復上步1次。
14.室溫12000~15000g離心1分鐘,甩干殘留液體。此步不能省略,否則殘留乙醇會影響DNA的后續(xù)使用(如DNA上樣時不能沉淀到加樣孔中)。
15. 將離心吸附柱置于一個新的1.5mL塑料離心管中,加入30-50μL 65-80℃預熱的DNA洗脫液,室溫放置2分鐘。常溫的DNA洗脫液也可以用于洗脫,但產量稍微有所降低。
16.室溫12000~15000g離心1分鐘,離心管底溶液即mtDNA。
17. 由于本公司離心吸附柱結合DNA能力較強,如果再加30-50μL DNA洗脫液到離心吸附柱中,往往還能洗脫下很多mtDNA(相當于次洗脫的20-30%),但注意不要使用上步得到的mtDNA溶液來洗脫。
18. 12000~15000g離心1分鐘,離心管底溶液即線粒體DNA。每107個動物細胞一般能得到100ng左右的mtDNA,每克組織一般能得到3-5μg mtDNA。如果DNA需要濃縮,可以使用本公司的核酸濃縮劑。
19. 由于DNA機械斷裂,電泳時DNA可能不呈現(xiàn)專一的帶,但此mtDNA溶液可以直接用于PCR。下列是公司正熱銷的產品：
16S rDNA PCR擴增檢測試劑盒家族受體α-4抗體流式組化
腸出血性大腸埃希菌（Enterohaemorrhagic E. coli）鑒定16S rDNA PCR擴增檢測試劑盒20次磷脂?；嫉鞍拙厶?3抗體流式組化
腸致病性大腸桿菌（Enteropathogenic E. coli）鑒定20次癌易感基因相關蛋白2
16S rDNA PCR擴增檢測試劑盒CD90抗體流式組化
腸集聚型大腸埃希菌（Enteroaggregative E. coli）鑒定20次L-谷氨酸二乙酯鹽酸鹽
16S rDNA PCR擴增檢測試劑盒D-半胱氨酸
腸侵襲性大腸桿菌（Enteroinvasive E. coli ）鑒定20次牛血紅蛋白
16S rDNA PCR擴增檢測試劑盒γ-球蛋白（牛）
副溶血性弧菌Vibrio parahaemolyticus）鑒定20次頭孢曲松鈉
16S rDNA PCR擴增檢測試劑盒環(huán)孢菌素A
霍亂弧菌（Vibrio cholerae）鑒定20次2′-脫氧肌苷
16S rDNA PCR擴增檢測試劑盒羥丙基-β-環(huán)糊精
耶爾森氏菌屬（Yersinia）鑒定20次羧甲基纖維素CM-32
16S rDNA PCR擴增檢測試劑盒苯甲脒瓊脂糖凝膠4FF
沙門氏菌（Salmonella）鑒定20次亞精
人類內源性逆轉錄病毒W家族RT-PCR試劑盒BIRC5/FITC 熒光素標記凋亡抑制因子5抗體IgGN-乙酰-DL-谷氨酸 BR
CD203c/FITC 熒光素標記CD203c抗體IgGN-乙酰-L-氨基乙酰 BR
CD203c/RBITC 紅色熒光素羅丹明(RBITC)標記抗CD203c抗體IgGN-乙酰-L-羥脯氨酸 BR
BNP/HRP 辣根過氧化物酶標記兔抗人腦鈉素抗體IgGN-乙酰-D-脯氨酸 98%
CD31/HRP 辣根過氧化物酶標記CD31抗體IgGN-乙酰-D-酪氨酸 BR
BK channel/FITC 熒光素標記BK通道蛋白抗體IgGL-氨酰鹽酸鹽 97%
BKCa channels/FITC 熒光素標記鈣激活通道蛋白抗體IgGDL-a-氨基己二酸 96%
Bmi1/PCGF4/FITC 熒光素標記組蛋白相關Bmi1抗體IgGBoc-L-谷氨酰 98%
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