操作流程:
1.從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
2.設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL；
3.樣本孔中加入待測樣本50μL；空白孔不加。
4.除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
5.棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機(jī)洗板）。
6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7.每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值。
產(chǎn)品特點(diǎn)：
1、公司產(chǎn)品僅用于科研不需要單獨(dú)純化線粒體，柱式法純化，操作簡單快捷。
2、得到的mtDNA可以直接用于PCR和酶切。
3、每107個(gè)動物細(xì)胞一般能得到100ng左右的mtDNA，每克組織一般能得到3～5μg mtDNA。
注意：本產(chǎn)品只適合于動物材料，不適合于植物材料，因?yàn)橹参锞€粒體DNA一般都十分巨大,非常難提。
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產(chǎn)品名稱
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牛呼腸???病毒探針法熒光定量RT-PCR試劑盒
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規(guī)格
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50次
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貨號
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FS-01P98829
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產(chǎn)品組成:
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成分
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規(guī)格
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溶液A
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13ml
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溶液B
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13ml
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溶液C
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18ml
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離心吸附柱
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50套
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通用洗柱液
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50ml
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DNA洗脫液
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10ml
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說明書
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1份
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使用方法:
一:培養(yǎng)細(xì)胞預(yù)處理
1. 用自備的0.25%胰酶消化液處理約107個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞,離心收集后棄上清。
2. 用PBS或TBS等緩沖液洗滌細(xì)胞兩次,離心得到的細(xì)胞沉淀直接用于mtDNA提取。
二:組織細(xì)胞預(yù)處理
3. 用剪刀將1g新鮮的動物組織剪碎(芝麻大小*),轉(zhuǎn)移到1.5mL塑料離心管中,用于mtDNA提取。注意:*不要使用凍存的動物組織,因?yàn)閮瞿^程中形成的冰晶會將線粒體刺破,使其DNA釋放出來被胞漿中的DNA酶降解,影響回收率。
三:血液預(yù)處理
4. 將3-5mL抗凝外周血靜置30分鐘或低速離心5分鐘,取白細(xì)胞層。
5. 用自備PBS洗滌白細(xì)胞兩次,得到的白細(xì)胞沉淀用于mtDNA提取。
柱式動物線粒體DNA提取試劑盒(PCR級)四:mtDNA提取
5.在細(xì)胞沉淀或剪碎的組織中加入250μL冰浴的溶液A,充分吹打分散。如果是剪碎的組織,不要等成塊的組織溶解即可繼續(xù)下步操作。
6. 加入250μL常溫的溶液B(如果溶液B有沉淀,用前須37℃加熱溶解后冷卻到室溫方可使用),溫和反復(fù)顛倒混勻10次。千萬不要劇烈振蕩。
7. 冰上放置6-8分鐘。注意不要超過8分鐘。
8. 加入350μL冰浴的溶液C,溫和混勻4-6次,可見白色沉淀物產(chǎn)生,然后放冰上放置20-25分鐘。
9.室溫12000~15000g離心10分鐘,小心將上清液轉(zhuǎn)移到離心吸附柱中。由于此時(shí)的溶液比重較大,有時(shí)候出現(xiàn)沉淀漂浮是正常現(xiàn)象,取上清時(shí)避開漂浮的沉淀即可。
10. 靜置5分鐘以讓DNA與離心吸附柱充分結(jié)合,此步十分重要。
11.室溫12000~15000g離心1分鐘,棄收集管中的廢液。
12. 加入500μL的通用洗柱液,室溫12000~15000g離心1分鐘,棄收集管中廢液。
注意:通用洗柱液中含乙醇,用后需要將蓋擰緊存放,否則乙醇會揮發(fā)。
13. 重復(fù)上步1次。
14.室溫12000~15000g離心1分鐘,甩干殘留液體。此步不能省略,否則殘留乙醇會影響DNA的后續(xù)使用(如DNA上樣時(shí)不能沉淀到加樣孔中)。
15. 將離心吸附柱置于一個(gè)新的1.5mL塑料離心管中,加入30-50μL 65-80℃預(yù)熱的DNA洗脫液,室溫放置2分鐘。常溫的DNA洗脫液也可以用于洗脫,但產(chǎn)量稍微有所降低。
16.室溫12000~15000g離心1分鐘,離心管底溶液即mtDNA。
17. 由于本公司離心吸附柱結(jié)合DNA能力較強(qiáng),如果再加30-50μL DNA洗脫液到離心吸附柱中,往往還能洗脫下很多mtDNA(相當(dāng)于次洗脫的20-30%),但注意不要使用上步得到的mtDNA溶液來洗脫。
18. 12000~15000g離心1分鐘,離心管底溶液即線粒體DNA。每107個(gè)動物細(xì)胞一般能得到100ng左右的mtDNA,每克組織一般能得到3-5μg mtDNA。如果DNA需要濃縮,可以使用本公司的核酸濃縮劑。
19. 由于DNA機(jī)械斷裂,電泳時(shí)DNA可能不呈現(xiàn)專一的帶,但此mtDNA溶液可以直接用于PCR。下列是公司正熱銷的產(chǎn)品：
組織3－羥－3－甲戊二酰輔酶A（HMG－COA）還原酶活性直接比色法20次兔尿激酶型纖溶酶原激活物受體（PLAUR/uPAR）Elisa測定試劑盒
定量檢測試劑盒兔抗平滑肌抗體（ASMA） Elisa測定試劑盒
血液3－羥－3－甲戊二酰輔酶A（HMG－COA）還原酶活性直接比色法20次兔子間粘附分子3（ICAM-3/CD50）Elisa測定試劑盒
定量檢測試劑盒骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2抗體流式組化
細(xì)胞3－羥－3－甲戊二酰輔酶A（HMG－COA）還原酶活性間接比色法20次成纖維生長因子受體2抗體流式組化
定量檢測試劑盒L-鳥氨酸乙酯鹽酸鹽
組織3－羥－3－甲戊二酰輔酶A（HMG－COA）還原酶活性間接比色法20次L-胱氨酸鹽酸鹽
定量檢測試劑盒15-150kDa分子量MARK
血液3－羥－3－甲戊二酰輔酶A（HMG－COA）還原酶活性間接比色法20次5-胞苷三磷酸二鈉鹽
定量檢測試劑盒5-鳥苷二磷酸二鈉鹽
3－羥－3－甲戊二酰輔酶A（HMG－COA）還原酶待測樣品制備試劑盒20次2′-脫氧胞苷
通用型蘋果酸脫氫酶（MDH）活性比色法定量檢測試劑盒20次山梨酸
細(xì)胞蘋果酸脫氫酶（MDH）活性比色法定量檢測試劑盒20次蘇丹Ⅱ
組織蘋果酸脫氫酶（MDH）活性比色法定量檢測試劑盒20次蘇丹紅7B
血液蘋果酸脫氫酶（MDH）活性比色法定量檢測試劑盒20次1-（3-二甲基丙基）-3-乙基碳二亞
牛呼腸孤病毒探針法熒光定量RT-PCR試劑盒PNAT/NAT2 N-乙?；D(zhuǎn)移酶2抗體疊氮基基硅烷 93%
PNK1/PNKP 多聚合苷酸激酶3磷酸化酶抗體3- 98%
Phospho-PNK1 (Ser114/Thr118) 磷酸化多聚合苷酸激酶3磷酸化酶抗體異酸氯磺酰酯 98%
Podoplanin/gp36 平足蛋白抗體三聚氯 99%
Pokemon 蒙蛋白抗體1,3-二氨基胍鹽酸鹽 97%
Polycystin 1 多囊腎蛋白1抗體基氫鈉 95%
Polycystin 2 多囊腎蛋白2抗體二鈉 96%
PP-1B 蛋白磷酸酯酶-1B抗體基氫鈉 1.0 M in THF
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