操作流程:
1.從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
2.設(shè)置標準品孔和樣本孔，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL；
3.樣本孔中加入待測樣本50μL；空白孔不加。
4.除空白孔外，標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
5.棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機洗板）。
6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7.每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值。
產(chǎn)品特點：
1、公司產(chǎn)品僅用于科研不需要單獨純化線粒體，柱式法純化，操作簡單快捷。
2、得到的mtDNA可以直接用于PCR和酶切。
3、每107個動物細胞一般能得到100ng左右的mtDNA，每克組織一般能得到3～5μg mtDNA。
注意：本產(chǎn)品只適合于動物材料，不適合于植物材料，因為植物線粒體DNA一般都十分巨大,非常難提。
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產(chǎn)品名稱
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牛源性成分探針法熒光定量PCR試劑盒
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規(guī)格
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50次
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貨號
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FS-01P98598
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產(chǎn)品組成:
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成分
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規(guī)格
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溶液A
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13ml
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溶液B
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13ml
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溶液C
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18ml
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離心吸附柱
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50套
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通用洗柱液
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50ml
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DNA洗脫液
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10ml
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說明書
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1份
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使用方法:
一:培養(yǎng)細胞預(yù)處理
1. 用自備的0.25%胰酶消化液處理約107個培養(yǎng)細胞,離心收集后棄上清。
2. 用PBS或TBS等緩沖液洗滌細胞兩次,離心得到的細胞沉淀直接用于mtDNA提取。
二:組織細胞預(yù)處理
3. 用剪刀將1g新鮮的動物組織剪碎(芝麻大小*),轉(zhuǎn)移到1.5mL塑料離心管中,用于mtDNA提取。注意:*不要使用凍存的動物組織,因為凍凝過程中形成的冰晶會將線粒體刺破,使其DNA釋放出來被胞漿中的DNA酶降解,影響回收率。
三:血液預(yù)處理
4. 將3-5mL抗凝外周血靜置30分鐘或低速離心5分鐘,取白細胞層。
5. 用自備PBS洗滌白細胞兩次,得到的白細胞沉淀用于mtDNA提取。
柱式動物線粒體DNA提取試劑盒(PCR級)四:mtDNA提取
5.在細胞沉淀或剪碎的組織中加入250μL冰浴的溶液A,充分吹打分散。如果是剪碎的組織,不要等成塊的組織溶解即可繼續(xù)下步操作。
6. 加入250μL常溫的溶液B(如果溶液B有沉淀,用前須37℃加熱溶解后冷卻到室溫方可使用),溫和反復(fù)顛倒混勻10次。千萬不要劇烈振蕩。
7. 冰上放置6-8分鐘。注意不要超過8分鐘。
8. 加入350μL冰浴的溶液C,溫和混勻4-6次,可見白色沉淀物產(chǎn)生,然后放冰上放置20-25分鐘。
9.室溫12000~15000g離心10分鐘,小心將上清液轉(zhuǎn)移到離心吸附柱中。由于此時的溶液比重較大,有時候出現(xiàn)沉淀漂浮是正?，F(xiàn)象,取上清時避開漂浮的沉淀即可。
10. 靜置5分鐘以讓DNA與離心吸附柱充分結(jié)合,此步十分重要。
11.室溫12000~15000g離心1分鐘,棄收集管中的廢液。
12. 加入500μL的通用洗柱液,室溫12000~15000g離心1分鐘,棄收集管中廢液。
注意:通用洗柱液中含乙醇,用后需要將蓋擰緊存放,否則乙醇會揮發(fā)。
13. 重復(fù)上步1次。
14.室溫12000~15000g離心1分鐘,甩干殘留液體。此步不能省略,否則殘留乙醇會影響DNA的后續(xù)使用(如DNA上樣時不能沉淀到加樣孔中)。
15. 將離心吸附柱置于一個新的1.5mL塑料離心管中,加入30-50μL 65-80℃預(yù)熱的DNA洗脫液,室溫放置2分鐘。常溫的DNA洗脫液也可以用于洗脫,但產(chǎn)量稍微有所降低。
16.室溫12000~15000g離心1分鐘,離心管底溶液即mtDNA。
17. 由于本公司離心吸附柱結(jié)合DNA能力較強,如果再加30-50μL DNA洗脫液到離心吸附柱中,往往還能洗脫下很多mtDNA(相當于次洗脫的20-30%),但注意不要使用上步得到的mtDNA溶液來洗脫。
18. 12000~15000g離心1分鐘,離心管底溶液即線粒體DNA。每107個動物細胞一般能得到100ng左右的mtDNA,每克組織一般能得到3-5μg mtDNA。如果DNA需要濃縮,可以使用本公司的核酸濃縮劑。
19. 由于DNA機械斷裂,電泳時DNA可能不呈現(xiàn)專一的帶,但此mtDNA溶液可以直接用于PCR。下列是公司正熱銷的產(chǎn)品：
酵母銅ATP酶（Cu＋＋ －ATPase）活性比色法量檢測試劑盒20次大鼠β2微球蛋白（BMG/β2-MG）ELISA試劑盒,
植物銅ATP酶（Cu＋＋ －ATPase）活性比色法量檢測試劑盒20次大鼠補體因子H（CFH）ELISA試劑盒,
鈣離子分析試劑專題大鼠骨粘連蛋白（ON）ELISA試劑盒,
名稱規(guī)格大鼠凝血酶抗凝血酶復(fù)合物（TAT）ELISA試劑盒,
細胞鈣離子濃度比色法定量檢測試劑盒20次大鼠抗IgE受體抗體ELISA試劑盒,
組織鈣離子濃度比色法定量檢測試劑盒20次大鼠球蛋白M（IgM）ELISA試劑盒,
體液鈣離子濃度比色法定量檢測試劑盒20次大鼠血小板活化因子（PAF）ELISA試劑盒,
食物鈣離子濃度比色法定量檢測試劑盒20次大鼠維生素D（VD）ELISA試劑盒,
環(huán)境鈣離子濃度比色法定量檢測試劑盒20次綿羊白介素2受體（IL-2R）ELISA試劑盒,
血清鈣比色法定量檢測試劑盒50次兔子氧化低密度脂蛋白（OxLDL）ELISA試劑盒,
胞漿內(nèi)鈣離子濃度熒光檢測試劑盒20次腦啡肽（ENK）ELISA試劑盒--動物，人
線粒體內(nèi)鈣離子濃度熒光檢測試劑盒20次游離睪酮（F-TESTO）ELISA試劑盒--動物，人
細胞內(nèi)鈣離子水平動態(tài)變化熒光檢測試劑盒20次副溶血性弧菌瓊脂用于副溶血性弧菌的選擇性分離培養(yǎng)
細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)鈣離子濃度熒光檢測試劑盒20次2′-氟脫氧胞苷
組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)鈣離子濃度熒光檢測試劑盒20次SP葡聚糖凝膠C-25
牛源性成分探針法熒光定量PCR試劑盒CD335/NKp46/NCR1 性受體NK-p46抗體3,5,5-基己 ≥95%, Kosher
CD336/NKp44/NCR2 性受體NK-p44抗體三(2-呋喃基)膦 99%
CD337/NKp30/NCR3 性受體NK-p30抗體雙硫磷 分析標準品
CD328/Siglec-7 唾液酸結(jié)合性球蛋白樣凝集素7抗體四乙基氯化銨，一水 99%
CD329/SIGLEC9 唾液酸結(jié)合性球蛋白樣凝集素9抗體四乙基硫酸氫銨 色譜級
KLRF1/NKp80 性受體NK-p80抗體四乙基硫酸氫銨 99%
SIGLEC10/SLG2 唾液酸結(jié)合性球蛋白樣凝集素抗體(S)-(+)-1,2,3,4-四氫-1-萘 >99%, ee >98%
Cdc6 分裂周期蛋白6抗體頻那 97%
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