冷凍保存細(xì)胞之方法？

冷凍保存方法一: 冷凍管置于4℃ 30~60 分鐘→ （-20 ℃30 分鐘） → -80 ℃16~18 小時（或隔夜） → 液氮槽vaporphase 長期儲存。

冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設(shè)定程序之可程序降溫機中每分鐘降1-3 ℃ 至–80 ℃ 以下， 再放入液氮槽vapor phase長期儲存。*-20 ℃不可超過1 小時， 以防止冰晶過大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80℃ 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

產(chǎn)品名稱：肺腺癌細(xì)胞；NCI-H292
形態(tài)特性：上皮樣

生長特性：貼壁生長

特征特性：該細(xì)胞株源自肺支氣管黏液上皮樣癌的結(jié)轉(zhuǎn)移灶；先用成份限定的培養(yǎng)基分離得到，然后換成含血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)條件下該細(xì)胞保留了黏液上皮的特性，可從其超微結(jié)構(gòu)的表現(xiàn)和多種鱗狀上皮分化標(biāo)記的表達而判斷。該細(xì)胞支持HBV的生長，多巴脫羧酶陰性。該細(xì)胞可以作為篩選模型，將人類亞基因組片段轉(zhuǎn)染入細(xì)胞來研究HBV及其自身基因在病毒性肝炎和肝癌發(fā)生中的作用。該細(xì)胞角蛋白、波形蛋白、黏液洋紅染色陽線，但神經(jīng)絲三聯(lián)蛋白陰性。

培養(yǎng)條件：RPMI1640+10%FBS

傳代方法：1:3~1:8傳代；2~3天換液1次。

培養(yǎng)操作：

1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有 1mL 細(xì)胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，加 入 4mL 培養(yǎng)基混合均 勻。在 1000RPM 條件下離心 4 分鐘，棄去上清液，補 加 1-2mL 培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培 養(yǎng)過夜（或?qū)?細(xì)胞懸液加入 10cm 皿中，加入約 8ml 培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。天換液并檢查細(xì)胞密度。

2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達 80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。      

1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的 PBS 潤洗細(xì)胞 1-2 次。

2. 加 1ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于 37℃培 養(yǎng)箱中消化 1-2 分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量培養(yǎng)基終止消 化。  

3. 按 6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在 1000RPM 條件下離心 4 分 鐘，棄去上清液，補加 1-2mL 培養(yǎng)液后吹勻。

4. 將細(xì)胞懸液按 1：2 比例分到新的含 8ml 培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

3）細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時，可進行細(xì)胞凍存。下面 T25 瓶為類；

1. 細(xì)胞凍存時，棄去培養(yǎng)基后，PBS 清洗一遍后加入 1ml 胰酶，細(xì)胞變圓 脫 落后，加入 1ml 含血清的培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計數(shù)板計數(shù)。

2. 4 min 1000rpm 離心去掉上清。加 1ml 血清重懸細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加 入血 清和 DMSO，輕輕混勻，DMSO 終濃度為 10%，細(xì)胞密度不低于1x106/ml，每支凍存管凍存 1ml 細(xì)胞懸液，注意凍 存管做好標(biāo)識。

3. 將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80 度冰箱，2 個小時以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取.

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NCI-H292細(xì)胞細(xì)小病B29-IgG抗體Elisa試劑盒FITC標(biāo)記的兔抗長爪沙鼠IgGMTF-1  金屬應(yīng)答元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子-1抗體

細(xì)小病B29-IgM抗體Elisa試劑盒堿性酶（AP）標(biāo)記的兔抗長爪沙鼠IgGMTCP1  成熟T增殖蛋白1抗體

轉(zhuǎn)錄中介因子1βElisa試劑盒膠體金標(biāo)記的兔抗長爪沙鼠IgGMTCH2  線粒體載體同源蛋白2抗體

化外紡錘體樣蛋白1Elisa試劑盒Cy3標(biāo)記的兔抗長爪沙鼠IgGMTCH1  增殖誘導(dǎo)蛋白60（早老素相關(guān)蛋白）

鳥苷交換因子Elisa試劑盒Cy5標(biāo)記的兔抗長爪沙鼠IgGMTCBP1/ADI1  膜型質(zhì)金屬蛋白酶胞質(zhì)尾結(jié)合蛋白1抗體

嘌呤能受體P2Y11Elisa試劑盒PE標(biāo)記的兔抗長爪沙鼠IgGMTBP/MDM2BP  雙微體2癌因結(jié)合蛋白抗體

血管緊張素Ⅰ受體抗體Elisa試劑盒APC標(biāo)記的兔抗長爪沙鼠IgGMTA2  轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白2抗體

載脂蛋白L2Elisa試劑盒Alexa Fluor 350標(biāo)記的兔抗長爪沙鼠IgGMTA1  腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白1抗體

蛋白酪氨酶OElisa試劑盒Alexa Fluor 488標(biāo)記的兔抗長爪沙鼠IgGMsx2/Hox8  同源盒因Msx2抗體
細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點：

1.研究的對象是活細(xì)胞

在實驗過程中，根據(jù)要求可始終保持細(xì)胞活力，并可長時間監(jiān)控、檢測甚至定量評估一部分活細(xì)胞的情況，包括活細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生命活動等。

2.研究條件可以人為控制

pH、溫度、氧氣、二氧化碳、張力等物理化學(xué)的條件，可以根據(jù)實際需要進行人為的控制，同時，可以施加化學(xué)、物理、生物等因素作為條件而進行實驗觀察，這些因素同樣可以處于嚴(yán)格控制之下。

3.研究的樣本可以達到比較均一性

通過細(xì)胞培養(yǎng)一定代數(shù)后，所得到的細(xì)胞系則可以達到均一性而屬于同一類型的細(xì)胞，需要時，可采用克隆化等方法使細(xì)胞達到純化。
4.研究內(nèi)容便于觀察、檢測和記錄采用各種研究技術(shù)：如倒置生物顯微鏡、熒光顯微鏡、電子顯微鏡、流式細(xì)胞術(shù)、激光共焦顯微鏡、組織化學(xué)、原位雜交、同位素標(biāo)記等各種儀器備。