甲基化特異性PCR
標(biāo)簽： 甲基化 特異性 PCR
DNA甲基化是一種表觀遺傳修飾，它是由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyl-transferase, Dnmt）催化S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，將胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?-甲基胞嘧啶（mC）的一種反應(yīng)，在真核生物DNA中，5-甲基胞嘧啶是**存在的化學(xué)性修飾堿基。
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實(shí)驗(yàn)方法原理
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MSP是一種簡(jiǎn)便、特異的、敏感的檢測(cè)單基因甲基化的方式。其基本原理是用亞硫酸氫鈉處理基因 組DNA，未甲基化的胞嘧啶變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶不變，然后用3對(duì)特異性的引物對(duì)所測(cè)基因的同一核苷酸序列進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物用DNA瓊脂糖凝膠電泳，凝膠掃描觀察分析結(jié)果。
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實(shí)驗(yàn)材料
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DNA
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試劑、試劑盒
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亞硫酸氫鈉、氫醌、石蠟油、乙醇
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儀器、耗材
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水浴鍋、PCR儀
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實(shí)驗(yàn)步驟
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1. 在50 μl 體系中，DNA（2~5 μg）經(jīng)NaOH（終濃度值0.2 mol/L）在37℃變性10 Min。
2. 對(duì)于ng級(jí)別的人基因組DNA，在進(jìn)行修飾前加入2μg蛙魚(yú)精DNA為載體。
3. 加入30 μl 剛配制好的10 mmo/L 氫醌與520/1的40.5%亞硫酸氫鈉混勻。
4. 然后用石蠟油隔絕空氣的條件下，避光在50%溫育16 h。
5. 修飾后的DNA過(guò)WizerdDNA純化柱，用50/1 L 水洗脫。
6. 室溫下用NaOH（終濃度為0.3 mol/L）修飾5 min，之后用乙醇沉淀。
7. DNA溶于20 μl 水中，立即使用或在-20℃保存。
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