超聲波破碎細(xì)胞儀使用時(shí)的常見(jiàn)問(wèn)題
1.用超聲波細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞時(shí)怎么有泡沫出現(xiàn)？
   解析：超聲功率：不宜太大，以免樣品飛濺或起泡沫，如小于 10ml 樣品容量，功
率應(yīng)在 200w 以?xún)?nèi),選用 2mm 超聲探頭，另將面板后面的變幅桿選擇開(kāi)關(guān)打到相應(yīng)擋；
10-200ml 樣品容量的功率在 200－400w，選用 6mm 超聲探頭，另將面板后面的變幅桿
打到相應(yīng)擋；200ml 以上的樣品容量功率在 300-600w 之間，選用 10mm 超聲探頭，另
將面板后面的變幅桿打到相應(yīng)擋；(2MM 的小探頭功率嚴(yán)禁超過(guò) 350W)
2.100g 大 腸 桿 菌 溶 于 1L 破 碎 液 里 ( 破 碎 液 ：
50mMTris-Cl(PH8.5)5mMEDTA0.14MNaCl)，攪拌，發(fā)現(xiàn)菌液發(fā)粘，菌體不能夠很好
   分散，用高壓勻質(zhì)機(jī)破碎，加壓后，菌液不能進(jìn)入勻質(zhì)機(jī)，速度很慢，請(qǐng)問(wèn)是何原因？
解析：將破碎液的量加大，不能很好分散可能是量太大；超聲處理5－10 分鐘，菌
液粘度即可大大降低，也可促進(jìn)菌體分散。
3.為什么用塑料大試管,玻璃的不可以嗎？
   解析：不可以的，如果使用玻璃管，可能會(huì)碎裂，而通常使用的是塑料試管。超聲
波是物質(zhì)介質(zhì)中的一種彈性機(jī)械波，它既是一種波動(dòng)形式,又是一種能量形式。超聲波破
碎儀對(duì)細(xì)胞的作用主要有熱效應(yīng)，空化效應(yīng)和機(jī)械效應(yīng)。熱效應(yīng)是當(dāng)超聲在介質(zhì)中傳播
時(shí)，摩擦力阻礙了由超聲引起的分子震動(dòng)，使部分能量轉(zhuǎn)化為局部高熱(42－43℃)?？?br>化效應(yīng)是在超聲照射下，生物體內(nèi)形成空泡，隨著空泡震動(dòng)和其猛烈的聚爆而產(chǎn)生出機(jī)
械剪切壓力和動(dòng)蕩。另外，空化泡破裂時(shí)產(chǎn)生瞬時(shí)高溫(約 5000℃)、高壓(可達(dá)
500×104Pa)，可使水蒸氣熱解離產(chǎn)生.OH 自由基和.H 原子，由.OH 自由基和.H 原子引起
的氧化還原反應(yīng)可導(dǎo)致多聚物降解、酶失活、脂質(zhì)過(guò)氧化和細(xì)胞殺傷。機(jī)械效應(yīng)是超聲
的原發(fā)效應(yīng)，超聲波在傳播過(guò)程中介質(zhì)質(zhì)點(diǎn)交替地壓縮與伸張構(gòu)成了壓力變化，引起細(xì)
胞結(jié)構(gòu)損傷。損傷作用的強(qiáng)弱與超聲的頻率和強(qiáng)度密切相關(guān)。
4.從細(xì)胞中提取酶，超聲波破碎儀破碎時(shí)間長(zhǎng)會(huì)影響到酶的活性，怎么辦？
   解析：如果需要的是胞內(nèi)酶，細(xì)胞破碎程度和需要的酶獲得之間基本上有正比關(guān)系。
破碎時(shí)間長(zhǎng)的確會(huì)影響到酶的活性。這就需要在*的破碎時(shí)間和酶活性之間做出判賽飛（中國(guó)）有限公司
斷，*直接的辦法是先繪制相關(guān)曲線(xiàn)(酶活性和時(shí)間的關(guān)系曲線(xiàn))。如果實(shí)驗(yàn)中超聲波破
碎儀破碎的是棒狀桿菌(也是很難破壁的 G+菌)，破碎時(shí)間控制在 30min 左右，酶活較
好。如果是基質(zhì)菌絲的話(huà),好可以考慮用溶菌酶處理一下。
5.大腸桿菌表達(dá)外源蛋白，在超聲破碎的時(shí)候，用含有 1%triton-X-100 的 PBS 懸
  浮，然后超聲的效果較好，1%triton-X-100 的作用還是很明顯的，對(duì)其他的一些**同
樣起作用，比如鏈霉菌。在表達(dá)重組蛋白后用超聲波細(xì)胞破碎儀破碎細(xì)胞，采用冰浴，
400w，破碎 2s 停 1s，但是不一會(huì)就產(chǎn)生大量泡沫，影響了破碎功率，pbs 和 tris 緩沖
液都是這樣，*后都是破碎不完全，而目的蛋白就在這些未破碎的細(xì)胞中，怎么辦？
解析：會(huì)產(chǎn)生氣泡是因?yàn)樘筋^位置沒(méi)放好；探頭一定要接近底部，約 0.5-1cm；功
率根據(jù)儀器不同會(huì)有所不同，但可以觀(guān)察液面，有波動(dòng)但不要太劇烈；可以選擇超聲波
細(xì)胞破碎儀破碎 3s 停 10s，破碎 20-30 次；變幅桿位置擺放也要注意，聽(tīng)聲音如果不對(duì)
的話(huà)就要及時(shí)調(diào)整；從菌濃度方面考慮。在破碎時(shí)試著加大體積，強(qiáng)度*不要超 過(guò)
60%；嘗試破碎 8s 停 8s，對(duì)有些菌體蛋白來(lái)說(shuō)，難散熱導(dǎo)致蛋白變性產(chǎn)生氣泡，可以
停頓時(shí)間稍長(zhǎng)一些，這種情況多見(jiàn)于包涵體形式的蛋白。
6. 鏈霉菌（放線(xiàn)菌）超聲破碎條件是什么？
  解析：放線(xiàn)菌屬于原核生物系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)上的（G＋C）摩爾百分含量（mol％）高的
革蘭氏陽(yáng)性菌（Eubacteria）分枝類(lèi)群，它雖然具有原核生物特有的分子生物學(xué)特性，
但在其不同類(lèi)群中，細(xì)胞壁的化學(xué)組分變化很大。在做大腸桿菌超聲時(shí)，采用的是 400W，
破碎 5s 停 5s 的方法，效果不錯(cuò)，但是用在鏈霉菌上，由于細(xì)胞壁組成差異一般沒(méi)什么
效果。 鏈霉菌（放線(xiàn)菌）超聲破碎前處理一般是配置成一定濃度的菌懸液。使用超聲
波細(xì)胞破碎儀破碎時(shí)采用的具體條件是：取**的 24 h 培養(yǎng)液于 5 000 r／min 下離心 5
min 收集菌體；用 pH 7．5 的 Na2HPO -NaH2PO 緩沖液洗滌 3 次，再用該緩沖液將菌
體配成 1：3 的菌懸液。置于 40 mL 大塑料試管內(nèi)；將大塑料試管置于冰浴中，采用超
聲波細(xì)胞破碎儀破碎(功率 200W，1／2”探頭，破碎 30s，間歇 30s)；破碎液于 12 000 r
／min 下高速冷凍離心 30 min，收集細(xì)胞碎片和上清夜。洗滌菌體也可以用預(yù)冷的生理
鹽水或 pH8 的 Tris－HCl，洗滌一次就可以。另外，超聲劑量隨樣品量、菌體改變比較
大，功率可以到 400－600w，破碎 5s，停 5s，冰浴，要加終濃度 1 mM 的 PMSF。為確
定合適的超聲強(qiáng)度和次數(shù)，有必要隨時(shí)鏡檢觀(guān)察菌體是否完全破碎。
7.我*近在做一個(gè)異源表達(dá)蛋白的純化，在進(jìn)行超聲波破碎時(shí)，總是破碎的不好，
   破碎離心后還是會(huì)有很多的細(xì)胞沉淀，不知道超聲波破碎有什么具體的要求嗎？我用的
是中等功率 400w，90 次，每次超 5 秒，停 5 秒。細(xì)胞是 BL21。 另外，我超的時(shí)候老
是會(huì)有泡沫出現(xiàn)，怎樣才能很好的防止泡沫出現(xiàn)？聽(tīng)有的人說(shuō)泡沫一出現(xiàn)蛋白就變性
了，不能做后期的酶活實(shí)驗(yàn)了，是這樣嗎？賽飛（中國(guó)）有限公司
解析：超聲后有點(diǎn)沉淀是可以理解的，異源蛋白在 BL21 表達(dá)時(shí)由于表達(dá)量比較高，
很肯能是有一部分以可溶形式存在，還有一部分是包涵體的形式存在，超聲后細(xì)胞碎片
以及包涵體經(jīng)離心后會(huì)沉下。如果你的包涵體比較多，這個(gè)沉淀的量還是很可觀(guān)的。
你的破壁條件是很常用的，一般為了保護(hù)機(jī)器都是要間歇性的超聲，5/5 用的很多。
100 次（16.7min）也足夠了，但不同的菌株可能有不同，我以前做的幾個(gè)菌株從 10min
到 25min 都有，但一般而言，如果你的蛋白不是是包涵體，建議超聲時(shí)間不宜太長(zhǎng)，機(jī)
械剪切力的影響必須考慮進(jìn)去。給你舉個(gè)例子，我在做一個(gè)蛋白時(shí)超聲時(shí)間設(shè)定在
25min，吵完后 12000rpm×10min 結(jié)果什么東西都離不下來(lái)，但 PAGE 發(fā)現(xiàn)其實(shí)很多蛋
白都已經(jīng)降解了，整個(gè)條帶像火箭電泳一樣。
超聲時(shí)注意的因素也就那么幾個(gè)：（1）首先是必須低溫，可以采用冰浴的方法控制
溫度。（2）超聲量不要太多，這個(gè)要自己去摸索，一定功率下的超聲體積太大很容易破
壁不完全。（3）菌體濃度不要太高，沉淀后的菌體重懸時(shí)控制好比例。
超聲時(shí)有泡沫出現(xiàn)的確不是件好事，很可能部分蛋白已經(jīng)變性失活，但也并不像你
想象的那樣蛋白酶活就全沒(méi)有了，可以測(cè)定一下還剩多少。超聲時(shí)出現(xiàn)泡沫的控制方法
我沒(méi)有專(zhuān)門(mén)試過(guò)，但我想兩個(gè)條件控制好應(yīng)該會(huì)減輕這個(gè)現(xiàn)象。（1）控制超聲時(shí)間，不
要無(wú)意義的延長(zhǎng)時(shí)間；（2）變輻桿下端深入液面以下多少要合適，太多太少都不行。
8.我要做的是 LDH（ 乳酸脫氫酶 ）的釋放率即上清/細(xì)胞+上清，但測(cè)細(xì)胞中的
  LDH 時(shí)需要破碎細(xì)胞，請(qǐng)問(wèn)破碎時(shí)需要注意哪些呢？
解析：1.超聲時(shí)要在冰浴下進(jìn)行；
2.超聲功率與容器的內(nèi)徑有很大關(guān)系：內(nèi)徑小，所需功率也小，不易引起氣泡；
反之則可能致使蛋白變性；
3.超聲前加些蛋白酶抑制劑有利于保護(hù)目的蛋白的活性；
4.超聲時(shí)間 5',間隙 15-20'，總時(shí)間 20min 左右。