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技術(shù)文章

細(xì)胞轉(zhuǎn)染
實(shí)驗(yàn)方法原理

細(xì)胞轉(zhuǎn)染

上圖所示是脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染的示意圖，它顯示了外源質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞的一般過程。

外源基因進(jìn)入細(xì)胞主要有四種方法：電擊法、磷酸鈣法和脂質(zhì)體介導(dǎo)法和病毒介導(dǎo)法。電擊法是在細(xì)胞上短時(shí)間暫時(shí)性的穿孔讓外源質(zhì)粒進(jìn)入；磷酸鈣法和脂質(zhì)體法是利用不同的載體物質(zhì)攜帶質(zhì)粒通過直接穿膜或者膜融合的方法使得外源基因進(jìn)入細(xì)胞；病毒法是利用包裝了外源基因的病毒感染細(xì)胞的方法使得其進(jìn)入細(xì)胞。但是由于電擊法和磷酸鈣法的實(shí)驗(yàn)條件控制較嚴(yán)、難度較大；病毒法的前期準(zhǔn)備較復(fù)雜、而且可能對(duì)于細(xì)胞有較大影響；所以現(xiàn)在對(duì)于很多普通細(xì)胞系，一般的瞬時(shí)轉(zhuǎn)染方法多采用脂質(zhì)體法。

利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法*重要的就是防止其毒性，因此脂質(zhì)體與質(zhì)粒的比例，細(xì)胞密度以及轉(zhuǎn)染的時(shí)間長(zhǎng)短和培養(yǎng)基中血清的含量都是影響轉(zhuǎn)染效率的重要問題，通過實(shí)驗(yàn)摸索的合適轉(zhuǎn)染條件對(duì)于效率的提高有巨大的作用。

細(xì)胞轉(zhuǎn)染

上圖是本次實(shí)驗(yàn)采用的脂質(zhì)體中陽離子組分的結(jié)構(gòu)的示意圖。

本次實(shí)驗(yàn)采用的脂質(zhì)體是promega公司的TransFast脂質(zhì)體試劑，它是一種陽離子脂質(zhì)體和中性脂質(zhì)體的混合物，是對(duì)于本次實(shí)驗(yàn)中采用的293T細(xì)胞優(yōu)化的轉(zhuǎn)染試劑。

實(shí)驗(yàn)材料

 

試劑、試劑盒

 

儀器、耗材

實(shí)驗(yàn)步驟

一、細(xì)胞傳代

1.   試驗(yàn)準(zhǔn)備：200 ul/1mlTip頭各一盒（以上物品均需高壓**），酒精棉球，廢液缸，試管架，微量移液器，記號(hào)筆，培養(yǎng)皿，離心管。

2.   棄掉培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，用1 ml的PBS溶液洗滌兩次。

3.  用Tip頭加入1 ml Trypsin液，消化1分鐘（37℃，5%CO2 ）。用手輕拍培養(yǎng)瓶壁，觀察到細(xì)胞完全從壁上脫落下來為止。

4.   加入1 ml的含血清培養(yǎng)基終止反應(yīng)。

5.   用Tip頭多次吹吸，使細(xì)胞完全分散開。

6.  將培養(yǎng)液裝入離心管中，1 000 rpm離心5 min。

7.   用培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后選擇0.8X106個(gè)細(xì)胞加入一個(gè)35mm培養(yǎng)皿。

8.  將合適體積完全培養(yǎng)液加入離心管中，混勻細(xì)胞后輕輕加入培養(yǎng)皿中，使其均勻分布。

9.  將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，**天轉(zhuǎn)染。

二、細(xì)胞轉(zhuǎn)染

1.  轉(zhuǎn)染試劑的準(zhǔn)備

（1）將400 ul去核酸酶水加入管中，震蕩10秒鐘，溶解脂狀物。

（2）震蕩后將試劑放在-20℃保存，使用前還需震蕩。

2.   選擇合適的混合比例（1：1-1：2/脂質(zhì)體體積：DNA質(zhì)量）來轉(zhuǎn)染細(xì)胞。在一個(gè)轉(zhuǎn)染管中加入合適體積的無血清培養(yǎng)基。加入合適質(zhì)量的MyoD或者EGFP的DNA，震蕩后在加入合適體積的轉(zhuǎn)染試劑，再次震蕩。

3.  將混合液在室溫放置10-15分鐘。

4.  吸去培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基，用PBS或者無血清培養(yǎng)基清洗一次。

5.  加入混合液，將細(xì)胞放回培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一個(gè)小時(shí)。

6.  到時(shí)后，根據(jù)細(xì)胞種類決定是否移除混合液，之后加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時(shí)。

三、**次細(xì)胞傳代

1.   在轉(zhuǎn)染后24小時(shí)，觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果并記錄綠色熒光蛋白表達(dá)情況。

2.   再次進(jìn)行細(xì)胞傳代，按照**染色合適的密度0.8X105個(gè)細(xì)胞/35 mm培養(yǎng)皿將細(xì)胞重新粉入培養(yǎng)皿中。

3.   在正常條件下培養(yǎng)24小時(shí)后按照染色要求條件固定。

4.  轉(zhuǎn)染條件優(yōu)化可以參考TransFast的使用說明書。

收起 
其他
一、研究進(jìn)展

1.  轉(zhuǎn)染技術(shù)
 
國(guó)際上推出了一些陽離子聚合物基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，以其適用宿主范圍廣，操作簡(jiǎn)便，對(duì)細(xì)胞毒性小，轉(zhuǎn)染效  轉(zhuǎn)染試劑率高受到研究者們的青睞。其中樹枝狀聚合物（Dendrimers）和聚乙烯亞胺（Polyethylenimine，PEI）的轉(zhuǎn)染性能*佳，但樹枝狀聚合物的結(jié)構(gòu)不易于進(jìn)一步改性，且其合成工藝復(fù)雜。聚乙烯亞胺是一種具有較高的陽離子電荷密度的有機(jī)大分子，每相隔二個(gè)碳個(gè)原子，即每“第三個(gè)原子都是質(zhì)子化的氨基氮原子，使得聚合物網(wǎng)絡(luò)在任何pH下都能充當(dāng)有效的“質(zhì)子海綿”(protonsponge)體。這種聚陽離子能將各種報(bào)告基因轉(zhuǎn)入各種種屬細(xì)胞，其效果好于脂質(zhì)聚酰胺，經(jīng)進(jìn)一步的改性后，其轉(zhuǎn)染性能好于樹枝狀聚合物，而且它的細(xì)胞毒性低。大量實(shí)驗(yàn)證明，PEI是非常有希望的基因**載體。目前在設(shè)計(jì)更復(fù)雜的基因載體時(shí)，PEI經(jīng)常做為核心組成成分。
 
2.  轉(zhuǎn)染效率
 
線型PEI（LinePEI,LPEI）與其衍生物用作基因轉(zhuǎn)染載體的研究比分枝狀PEI（BranchedPEI,BPEI）要早一些，過去的研究認(rèn)為在不考慮具體條件，LPEI/DNA轉(zhuǎn)染復(fù)合物的細(xì)胞毒性較低，有利于細(xì)胞定位，因此與BPEI相比應(yīng)該轉(zhuǎn)染效率高一些。但*近研究表明BPEI的分枝度高有利于形成小的轉(zhuǎn)染復(fù)合物，從而提高轉(zhuǎn)染效率，但同時(shí)細(xì)胞毒性也增大。超高分枝的、較柔性的PEI衍生物含有額外的仲胺基和叔胺基，在染實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)這種PEI的毒性低，但轉(zhuǎn)染效率卻較高。
 
GenEscort是采用各種分枝狀和超高分枝狀的小分子PEI與各種含有生理?xiàng)l件下可降解鍵的交聯(lián)劑交聯(lián)，合成出的一系列高分枝的可降解的PEI衍生物。聚合物的分枝結(jié)構(gòu)使得其具有較高的正電性，因此易于高效地包裹各種DNA、RNA分子及質(zhì)粒形成小的納米顆粒，從而提高轉(zhuǎn)染效率，當(dāng)所形成復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞以后，其中所含的生理?xiàng)l件下可降解的化學(xué)鍵在細(xì)胞內(nèi)水解，使交聯(lián)聚合物分解為無細(xì)胞毒性的小分子PEI，這樣結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)染試劑在體外應(yīng)用可以獲得高的轉(zhuǎn)染效率和低的細(xì)胞毒性，其可降解性對(duì)體內(nèi)應(yīng)用也具有重要的意義。