**定量PCR技術(shù)（real-timeimmuno-PCR）是把抗原抗體反應(yīng)的高特異性和聚合酶鏈反應(yīng)的高敏感性有機(jī)結(jié)合起來(lái)，其本質(zhì)是一種以PCR擴(kuò)增一段DNA報(bào)告分子代替酶反應(yīng)來(lái)放大抗原抗體結(jié)合率的一種改良型ELISA。

（1） real-time immuno-PCR的基本原理

real-timeimmuno-PCR主要由兩個(gè)部分組成：

部分是類(lèi)似于普通酶聯(lián)**吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）的抗原抗體反應(yīng)。

**部分即熒光定量PCR。

Real-time immuno-PCR與ELISA的區(qū)別就在于ELISA是以堿性磷酸酶或辣根過(guò)氧化物酶來(lái)標(biāo)記抗體，用顏色反應(yīng)來(lái)表明陽(yáng)性或陰性結(jié)果，而前者是以一段特定的雙鏈或單鏈DNA來(lái)標(biāo)記抗體，用PCR擴(kuò)增抗體所連接的DNA，因此可由PCR產(chǎn)物的量來(lái)反映抗原分子的量。

由于熒光定量PCR的高靈敏度，只要存在著極微量的抗原抗體反應(yīng)，都能被檢測(cè)到。real-timeimmuno-PCR的關(guān)鍵之處就在于用一個(gè)連接分子將一段特定的DNA連接到抗體上，在抗原和DNA之間建立相對(duì)應(yīng)關(guān)系，從而將對(duì)蛋白質(zhì)的定量檢測(cè)轉(zhuǎn)變?yōu)閷?duì)核酸的定量檢測(cè)。

（2） real-time immuno-PCR體系的組成

**PCR體系由待檢抗原，特異性抗體，連接分子，DNA和PCR擴(kuò)增系統(tǒng)組成。

1．待檢抗原：被檢測(cè)的樣品可以是抗原，或者是作為抗原的某種抗體。待檢的抗原可以直接吸附于固相，這一過(guò)程與ELISA試驗(yàn)是相同的，因此有些吸附性差的抗原不能應(yīng)用目前介紹的**PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，需要對(duì)**PCR進(jìn)行改進(jìn)，以便能夠檢測(cè)吸附性差的抗原。**PCR的后續(xù)過(guò)程需PCR擴(kuò)增，目前有些方法應(yīng)用的固相板或管是專(zhuān)門(mén)用于**PCR，并且有些PCR僅可以直接用微量板進(jìn)行擴(kuò)增，這樣可以簡(jiǎn)化實(shí)驗(yàn)過(guò)程和提高檢測(cè)的性。**PCR具有非常高的敏感性，特別適用于檢測(cè)微量抗原。

2．特異抗體：**PCR中的特異性是對(duì)應(yīng)于待測(cè)抗原，與ELISA一樣，抗體的特異性和親和力將影響**PCR的特異性和敏感性。一般均選用單抗體，這個(gè)抗體常采用生物素標(biāo)記，通過(guò)親和素再結(jié)合DNA。

3．DNA和PCR系統(tǒng)：**PCR中的DNA是一指示分子，用DNA聚合酶將結(jié)合于固相上的DNA特異放大，由此定量檢測(cè)抗原。**PCR的敏感性高于ELISA主要是借助了PCR強(qiáng)大的擴(kuò)增能力。**PCR中的DNA分子可以選擇任何DNA，但要保證DNA的純度，且有較好的均質(zhì)性，盡可能不選用受檢樣品中可能存在的DNA。一般可選用質(zhì)粒DNA或PCR產(chǎn)物等。DNA的生物素化是用生物素標(biāo)記的dATP或dUTP通過(guò)聚合酶標(biāo)記在DNA分子上，一般是1個(gè)分子DNA標(biāo)記2個(gè)生物素，標(biāo)記率可達(dá)****。**PCR的PCR擴(kuò)增系統(tǒng)與一般PCR一樣，主要包括引物、緩沖液和耐熱DNA聚合酶。

4．連接分子：連接分子是連接特異抗體與DNA之間的分子。Sano等用鏈親和素/蛋白A(striptavidin-proteinA)基因工程融合體作為連接分子來(lái)連接生物素標(biāo)記的DNA與抗體，此種融合蛋白的鏈親和素部分可識(shí)別DNA上的生物素，蛋白部分可識(shí)別抗體的Fc段。