凝膠成像系統(tǒng)的基本骨包含:CCD相機,暗室和分析軟件。不過其功能不僅**于對瓊脂糠凝膠進行成像,現(xiàn)在的成像儀趨向于多功能化,還適用于蛋白膠、發(fā)熒光的膠、印跡膜和菌落平板等應(yīng)用。在Western Blot方面,高性能的CCD分子成像系統(tǒng)能與膠片媲美。
(1)、分辨率
分辨率的大小和像素值是分不開的,像素指得是CCD能分別的小的感光元件,我們平時說的多少萬像素就是這些感光元件的個數(shù)了。所以一般來講像素越多,成像也就越清晰細膩,當(dāng)然這其中還要受許多因素限制,下面會慢慢提到的。但是高像素也不一定是好的CCD,其原因就是像素大?。≒ixel Size),也是很重要的因素,相同數(shù)目的像素,排列越密集,像素之間就越容易出現(xiàn)電流干擾,容易出現(xiàn)"噪點"等干擾成像質(zhì)量的現(xiàn)象出現(xiàn)。由于制造工藝的限制,增加尺寸,成本將會以幾何級數(shù)提高。
現(xiàn)在大部分廠家的CCD為了提高圖像的靈敏度,會使用像素合并的技術(shù),那么像素合并的意義是什么呢?
像素合并是一種非常有用的功能,它可被用來提高像素的大小和靈敏度,如圖所示分辨率為795512,像素大小為9u,當(dāng)經(jīng)過22合并后,變成398256,像素大小為18u.33合并后,變成265170,像素大小為27u,靈敏度提高9倍,這樣每個像素大小為27u.
(2)、動態(tài)范圍值
動態(tài)范圍表示在一個圖像中亮與暗的比值。
灰階表示在一種表征光亮度的方法,12bit表示從暗到亮等分為212=4096個級別,16bit即分為216個級別,可見bit值越高能分出的細微差別越大,如圖下面這張圖片人眼只能分辨出40個灰階,而對于一臺12bit的儀器能分辨出4,096個灰階。值得一提的是,目前來說,市場上主流的凝膠成像的CCD以12bit為主,16bit的儀器一般情況下,分辨率均在200萬像素左右,對于真正的16bit,而像素值又近400萬的CCD是非常少見的。
12bit與16bit在圖像分辨上的區(qū)別
對動態(tài)范圍進行量化需要一個運算公式,即動態(tài)范圍值 = 20 log (well depth/read noise),其中Well depth代表是滿井電子,是CCD飽和時能接受的電子信號總值,read noise是讀出噪聲(以電子數(shù)來表示),每個CCD在讀數(shù)的過程中都會產(chǎn)生噪聲,噪聲越小,監(jiān)測靈敏度越高。其中滿井電子與CCD的bit值是相關(guān)的,通常下,bit值越高,滿井電子的數(shù)值越大。
舉例如下:
Well depth = 85,000 個電子, read noise = 12 個電子
Dynamic range = 20 log (85,000/12), or 77dB.
動態(tài)范圍的值越高CCD性能越好.
(3)、量子效率
CCD的量子效率也稱像素靈敏度,指在一定的曝光量下,像素勢阱中所積累的電荷數(shù)與入射到像素表面上的光子數(shù)之比。不同結(jié)構(gòu)的CCD其量子效率差異很大。比如100光子中積累到像素勢阱中的電荷數(shù)是50個,則量子效率為50%(100 photons = 50 electrons means 50% efficiency)。值得注意的是CCD 的量子效率與入射光的波長有關(guān)。
(4)、信噪比
說到信噪比就不得不提到暗電流了,暗電流是導(dǎo)致CCD噪音的很重要的因素。暗電流指在沒有曝光的情況下,在一定的時間內(nèi),CCD傳感器中像素產(chǎn)生的電荷。我們在做化學(xué)發(fā)光檢測的時候,需要的曝光的時候比較長,這樣導(dǎo)致CCD產(chǎn)生較多的暗電流,對圖像的質(zhì)量影響非常大。通常情況下通過降低CCD的溫度來大限度的減少暗電流對成像的影響。下圖表明了暗電流與溫度的關(guān)系,從圖中我們可以看出,CCD產(chǎn)生的暗電流隨著溫度下降而減少,但是在-23℃下曲線開始趨于平緩,由此可以看出溫度并非需要無休止的降低的。所以在選擇冷CCD時,溫度在-25℃(溫度,非室溫以下)下一般就可以達到您的要求了。
有的CCD是在圖像終生成后,通過軟件去背景來扣除暗電流,對于信號遠遠強于背景的有一定效果,但是對于弱信號處理過程中會產(chǎn)生越來越多的錯誤。
以上是關(guān)于CCD的原理和影響因素的一些介紹,
(5)光學(xué)鏡頭
光學(xué)鏡頭是機器視覺系統(tǒng)中必不可少的部件,直接影響成像質(zhì)量的優(yōu)劣,影響算法的實現(xiàn)和效果。光學(xué)鏡頭規(guī)格繁多,有時不免頭暈。光學(xué)鏡頭從焦距上可分為短焦鏡頭、中焦鏡頭,長焦鏡頭;從視場大小分有廣角、標(biāo)準,遠攝鏡頭;結(jié)構(gòu)上分有固定光圈定焦鏡頭,手動光圈定焦鏡頭,自動光圈定焦鏡頭,手動變焦鏡頭、自動變焦鏡頭,自動光圈電動變焦鏡頭,電動三可變(光圈、焦距、聚焦均可變)鏡頭等。
(6)濾光鏡片
熒光:EB 、TLC plates、GFP plates、SYBR Green、SYBR Gold、SYBR Safe、SYPRO Red、SYPRO Orange、Texas Red、Rhodamine Red、Fluorescein、Deep Purple、Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、熒光板等(要根據(jù)具體的激發(fā)光源和濾鏡來決定)
光源 激發(fā)波長 吸收波長 染料
Blue 475nm 537nm SYBR Green、SYBR Gold、SYBR Safe、SYPRO Orange、Cy2等
Green 534nm 606nm SYPRO Red、Cy3等
Red 632nm 609nm Texas Red、Rhodamine Red 、Cy5等
(7)、數(shù)據(jù)傳輸
IEEE1394總線是一種目前為止快的高速串行總線,火線(IEEE1394)支持的傳輸速率有100Mbps,200Mbps,400Mbps,高的傳輸速度為400Mbps/s。對于各種需要大量帶寬的設(shè)備了專門的優(yōu)化,接口可以同時連接63個不同設(shè)備,IEEE1394同USB一樣,支持帶電插撥設(shè)備。IEEE1394同樣支持即插即用,現(xiàn)在的WIN98 SE、WIN2000、WIN ME、WIN XP都對IEEE1394支持的很好,在這些操作系統(tǒng)中用戶不用再安裝驅(qū)動程序,也能使用IEEE1394設(shè)備。
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