作為目前好、專(zhuān)業(yè)的引物設(shè)計(jì)軟件，Oligo的功能很強(qiáng)，在這里我們介紹它的一些主要功能，如：普通引物對(duì)的搜索、測(cè)序引物的設(shè)計(jì)、雜交探針的設(shè)計(jì)以及評(píng)估引物對(duì)質(zhì)量等等。
在正式進(jìn)行引物設(shè)計(jì)前，我們首先面臨的一個(gè)任務(wù)就是向Oligo程序?qū)肽０逍蛄?，根?jù)不同的實(shí)驗(yàn)情況，導(dǎo)入模板有三種方法：
1、直接用鍵盤(pán)輸入：
a、點(diǎn)擊file菜單中的New Sequence 浮動(dòng)命令，或直接點(diǎn)擊工具欄中的New Sequence命令，進(jìn)入序列展示窗口；
b、此時(shí)即可鍵入DNA序列；
c、如果需要的話，Oligo堿基回放功能，在邊鍵入時(shí)邊讀出堿基，防止輸入錯(cuò)誤。點(diǎn)擊Edit菜單中的“Readback on”即可。
2、利用復(fù)制和粘貼：當(dāng)我們序列已經(jīng)作為T(mén)XT文件存在或其它oligo不能直接open的文件格式，如word文件。html格式，這個(gè)功能就顯得很有用了。在相應(yīng)文件中復(fù)制序列后在序列展示窗口粘貼，oligo會(huì)自動(dòng)去除非堿基字符。當(dāng)序列輸入或粘貼完成后，點(diǎn)擊Accept/Discard菜單中的Accept浮動(dòng)命令，即可進(jìn)入引物設(shè)計(jì)模式。
3、如果序列已經(jīng)保存為Seq格式或者FASTA,GenBank格式時(shí)，oligo就可以直接打開(kāi)序列文件。
點(diǎn)擊File菜單中的“Open”浮動(dòng)命令，找到所需文件，打開(kāi)即可。
進(jìn)入引物設(shè)計(jì)模式后，oligo一般會(huì)彈出三個(gè)窗口，分別是6-堿基頻率窗口，堿基退火溫度窗口以及序列內(nèi)部堿基穩(wěn)定性窗口，其中的退火溫度窗口是我們引物設(shè)計(jì)的主窗口，其它的兩個(gè)窗口則在設(shè)計(jì)過(guò)程中起輔助作用，比如6-堿基頻率窗口可以使我們很直觀地看到所設(shè)計(jì)引物在相應(yīng)物種基因組中的出現(xiàn)頻率，如果我們的模板是基因組DNA或混合DNA時(shí)，該信息就顯得有用了，而內(nèi)部穩(wěn)定性窗口則可以顯示引物的5‘端穩(wěn)定性是否稍高于3’端等。
一、普通引物對(duì)的搜索：
以Mouse 4E（cDNA序列）為例。我們的目的是以Mouse 4E（2361 bp）為模板，設(shè)計(jì)一對(duì)引物來(lái)擴(kuò)增出600-800bp長(zhǎng)的PCR產(chǎn)物。
1、點(diǎn)擊“Search”菜單中的“For Primers and Probes”命令，進(jìn)入引物搜索對(duì)話框；
2、由于我們要設(shè)計(jì)的是一對(duì)PCR引物，因此正、負(fù)鏈的復(fù)選框都要選上，同時(shí)選上Compatible pairs.
在Oligo默認(rèn)的狀態(tài)下，對(duì)此引物對(duì)的要求有：a、無(wú)二聚體；b、3‘端高度特異，GC含量有限定，d、去除錯(cuò)誤引發(fā)引物等。
3、剩下的工作是確定上、下游引物的位置及PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度以及引物設(shè)計(jì)參數(shù)。
①單擊：“search Ranges”按鈕，彈出“Search Ranges”對(duì)話框。輸入上游引物的范圍：1-2000,下游引物的位置：100-2300;PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度600-800bp.
②單擊“Paramaters”按鈕進(jìn)入“Search Parameters”對(duì)話框，對(duì)話框種分三個(gè)活頁(yè)，分別是：不同設(shè)定，參數(shù)以及更多參數(shù)。
③在“普通設(shè)定”窗口，為我們了對(duì)引物非常直觀的設(shè)定方法，從高到低分六個(gè)等級(jí)，后還有一個(gè)用戶定制選項(xiàng)。
④當(dāng)我們對(duì)引物的各種參數(shù)的含義及應(yīng)該設(shè)定多大值并不是特別清楚時(shí)，就可以直接設(shè)定Very high/High等來(lái)完成對(duì)引物設(shè)計(jì)參數(shù)的設(shè)定。
⑤當(dāng)我們選中“Automatically Change String”后，Oligo會(huì)在引物搜索過(guò)程中：如果在高等級(jí)設(shè)定中無(wú)法找到引物對(duì)時(shí)自動(dòng)降低一個(gè)定級(jí)來(lái)進(jìn)行搜索，知道找到引物對(duì)。在設(shè)計(jì)反向PCR引物對(duì)時(shí)，就選中“Inverse PCR”復(fù)選框。
⑥我們還可以讓引物的長(zhǎng)度可以改變，以適應(yīng)設(shè)定的Tm值或PE?（Prime Effitions,引發(fā)效率）。也可以限定所選引物對(duì)的大數(shù)目。
⑦在“Parameters”窗口中，實(shí)際上需要我們改動(dòng)的只有引物的長(zhǎng)度，根據(jù)試驗(yàn)的要求作相應(yīng)的改變，如23nt.其他參數(shù)就使用Oligo的默認(rèn)值，一般無(wú)需改變。在“More Parameters”窗口中，一般也無(wú)需作任何改變，直接用Oligo的默認(rèn)值。
4、點(diǎn)擊“確認(rèn)”-“Ok”進(jìn)入搜索窗口，再次單擊“OK”后，Oligo自動(dòng)完成引物對(duì)的搜索，并出現(xiàn)一個(gè)搜索結(jié)果窗口。顯示出得到的引物對(duì)數(shù)目。
5、點(diǎn)擊“Ok”，出現(xiàn)“PrimerPairs”窗口，在窗口中列出了7對(duì)引物的簡(jiǎn)單信息，引物位置，產(chǎn)物長(zhǎng)度，佳退火溫度及GC含量。單擊“Sort”按鈕，可以按產(chǎn)物長(zhǎng)度，佳退火溫度及GC含量從小到大或從大到小的順序排列。
6、點(diǎn)擊任意一對(duì)引物，在旁邊馬上彈出一個(gè)叫“PCR”的窗口，在窗口中我們可以看到這對(duì)引物在模板中的大概位置，佳退火溫度（該溫度可以直接應(yīng)用于我們實(shí)際PCR中的**步退火）。另外還有引物的Tm值，GC含量，引發(fā)效率，同時(shí)還計(jì)算出了產(chǎn)物的Tm值于引物Tm值的差異以及引物間Tm值的差異。一般我們盡量保持前者在20度以?xún)?nèi)，后者在5-6度以?xún)?nèi)。點(diǎn)擊不同的引物對(duì)時(shí)，PCR窗口內(nèi)容同時(shí)作相應(yīng)的改變。
7、要想了解引物的詳細(xì)信息，如二聚體，發(fā)卡結(jié)構(gòu)形成情況、組成、Tm值和錯(cuò)誤引發(fā)位點(diǎn)等，這時(shí)只需點(diǎn)擊“Analyze”菜單中的相應(yīng)命令，就可以分別得到相關(guān)信息。例如點(diǎn)擊“Duplex Formation”,我們就可以得到上游引物間，下游引物間及上下游引物間形成二聚體的情況。同理，“Hairpin Formation”,“Composition and Tm”,“False Priming Sites”等命令就可以顯示出相關(guān)信息。所有這些分析的結(jié)果都有助于我們從Oligo搜索得到的多對(duì)引物中選擇佳的引物對(duì)。
需要說(shuō)明的是，①如果一次搜索得到的引物對(duì)太多時(shí)，我們可以適當(dāng)提高選定的條件和規(guī)定更合適的搜索范圍來(lái)減少引物對(duì)數(shù)；②引物一般盡量不要在3‘端或是離3’端太近的位置形成二聚體，同時(shí)二聚體的自有能值盡量小于10;3,對(duì)于錯(cuò)誤引發(fā)，在普通PCR中，如果引發(fā)效率在160 points以上時(shí)，就可能出現(xiàn)雜帶，在測(cè)序反應(yīng)中，錯(cuò)誤引發(fā)效率則應(yīng)該嚴(yán)格控制在120 points以下。
8、Oligo中每對(duì)引物的詳細(xì)信息可以直接導(dǎo)出為一個(gè)文本文件：
首先點(diǎn)擊“File”菜單中的“Print/Save Options”，在出現(xiàn)的對(duì)話框中的普通設(shè)定選中“Selected”；在“Analyze I”中選擇需要保存的信息，在“Analyze II”中選中PCR.
單擊確定按鈕退出，這時(shí)再次點(diǎn)擊“File”菜單，Save浮動(dòng)命令中的“Data Save as”,選擇路徑及文件名即可。
二、測(cè)序引物的設(shè)計(jì)
在oligo中，測(cè)試引物設(shè)計(jì)過(guò)程與普通引物設(shè)計(jì)大部分都很相似。
還是以Mouse 4E為例，假如我們要在600-800bp的位置設(shè)計(jì)一條測(cè)序引物。
Open-Search
在“Search”窗口中，選中“Sequence Rrimer”,同時(shí)去除負(fù)鏈Search的選中
在“Search Range”窗口，輸入正鏈的600-800bp
在“Parameters”中選定very high，引物長(zhǎng)度改為18bp
結(jié)果行到11條測(cè)序引物，與普通引物同理，根據(jù)其詳細(xì)信息就可以挑選到一條佳的測(cè)序引物。
三、探針的設(shè)計(jì)：
探針的設(shè)計(jì)與測(cè)序引物設(shè)計(jì)基本相同，只需使“Search”窗口的探針設(shè)計(jì)選中，改變探針的長(zhǎng)度就可以。
四、評(píng)估引物對(duì)：
我們?cè)诟鞣N文獻(xiàn)中查到的引物，如果直接進(jìn)行PCR,往往很難重復(fù)別人的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。這時(shí)就想到，是不是引物的質(zhì)量有問(wèn)題？能不能用軟件來(lái)對(duì)這些問(wèn)題引物進(jìn)行一些分析呢？答案是肯定的。
1、點(diǎn)擊File菜單中的New命令；
2、在“Edit New Sequence”的窗口中用鍵盤(pán)輸入上游引物；
3、如果該引物的首位置不是1的話，可以在“Edit”窗口中輸入新的5‘端位置數(shù)字，如20;
4、點(diǎn)擊Accept/Discard菜單的Accept命令；
5、如果引物序列長(zhǎng)度不同于當(dāng)前的引物的話，可以從“Change”菜單中改變當(dāng)前的引物長(zhǎng)度；
6、選取當(dāng)前序列為上游引物（點(diǎn)擊“upper”按鈕）；
7、從Edit菜單中選取“Lower Primer”命令，在Edit Lower窗口中輸入下游引物的序列；
8、在Edit窗口的上角處，輸入相應(yīng)的5’位置；
9、選取“Accept and Quit”命令；
如果想讓程序給出佳退火溫度，在此時(shí)的對(duì)話框中輸入PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度以及GC含量所占百分比，一般哺乳動(dòng)物的cDNA序列中GC大約占44%.
10、點(diǎn)擊OK就可以在“Analyze”菜單中完成各種分析了。
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