1、功能基因克隆的基本策略
① 根據(jù)已知的脊椎動物某一特定基因的氨基酸序列的保守區(qū)域設(shè)計簡并引物，利用RT-PCR技術(shù)獲得該基因的核心片斷，將該片斷分離純化后與T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，挑取白色菌落，經(jīng) PCR反應(yīng)鑒定得到陽性克隆，送陽性克隆的PCR產(chǎn)物去測序，從而獲得目的基因的cDNA核心片斷的序列。
② 利用3'-RACE 和5'-RACE 技術(shù)擴增cDNA的3‘末端和5’末端，將cDNA核心片斷、3‘末端和5’末端進(jìn)行序列拼接，從而獲得全長cDNA序列。
③ 通過基因組PCR獲得內(nèi)含子DNA序列，通過基因組步移技術(shù)進(jìn)一步克隆該基因的5‘側(cè)翼序列（含啟動子及其它順式調(diào)控）和3' 側(cè)翼序列，從而獲得該基因的基因組DNA全序列。
2、引物設(shè)計基本原則
細(xì)心地進(jìn)行引物設(shè)計是PCR 中重要的一步。理想的引物只跟目的序列兩側(cè)的單一序列而非其他序列退火。設(shè)計糟糕的引物可能會擴增出其他非目的序列。下面的指導(dǎo)描述了一個可以增加特異性引物所具有的令人滿意的特點：
① 典型的引物長18-24bp.引物足夠長，保證序列特異性，并降低序列存在于非目的序列位點的可能性。但是長度大于24bp 的引物并不意味著更高的特異性。較長的序列可能會與錯誤配對序列雜交，降低特異性，而且比短序列雜交慢，從而降低了產(chǎn)量。
② 選擇GC 含量為40%-60%.高GC 含量導(dǎo)致形成穩(wěn)定的不正確的配對，而高AT 含量降低正確配對的Tm值。
③ 設(shè)計5’端和中間區(qū)為G 或C的引物。這會增加引物的穩(wěn)定性和引物同目的序列雜交的穩(wěn)定性。
④ 避免多堿基序列（如poly dG）或者重復(fù)結(jié)構(gòu)域的延伸--它們能夠在模板上進(jìn)行不正確的配對。
⑤ 避免在PCR反應(yīng)中使用與其它引物互補的序列，以阻止引物之間的配對，形成引物二聚體，抑制擴增。
⑥ 在引物5‘末端加入限制性酶切位點序列時，一定要包含幾個額外的堿基（2-6堿基）作為固定，以防止5’末端在消化時的移動。
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