1.從引物自身著手,重新設計引物,這是根本解決這一問題的辦法。 2.可能模板有問題,模板濃度過小,適當加大模板量。 3.Taq酶,引物,Mg2+濃度可能過高,可降低它們的濃度。 4.將上下引物混合后,在100℃的沸水中煮5分鐘,然后迅速拿出至于冰塊之上瞬時冷卻,這時再加入反應體系當中,引物二聚體就會消失的。理由:引物可能會發(fā)**夾結(jié)構(gòu),自身環(huán)化等結(jié)構(gòu),在100℃的沸水中煮5分鐘可使引物變?yōu)閱捂?,以減少二聚體。不過有人認為在PCR儀上95度變性5min也同樣達到目的,而且成功試過通過延長退火時間也可以消除引物二聚體。 5.所配MIX中加5%的甘油或者5%的DMSO,可以增強特異性。 6.PCR反應體系的配制在冰上進行,后加Taq酶,PCR結(jié)束后,產(chǎn)物勿放置在室溫下過長時間,有人認為室溫下有些Taq酶會將多余的引物合成為二聚體。 7.增加循環(huán)數(shù) 8.降低退火溫度后有條帶,則應逐漸提高溫度,若提高溫度的同時產(chǎn)物量減少,則考慮增加Mg2+濃度(根據(jù)擴增片斷長度而定,片段長則相應鎂離子濃度應該高一些)。 9.若降低退火溫度,發(fā)現(xiàn)還是只有引物二聚體,而且鎂離子的濃度在20-25mmol/l沒有區(qū)別,則考慮Buffer等試劑沒有完全融解、混勻,導致吸取的試劑濃度不對。 10.以上次的PCR產(chǎn)物作模板二次PCR,可以提高引物與模板的特異性,減少引物二聚體,如果兩次時間間隔短的話,可以把原產(chǎn)物稀釋100-1000倍,如果間隔較長可以稀釋50-100倍。 華東生物器材網(wǎng)(www.jp1718.com)是上海金鵬旗下網(wǎng)站。本網(wǎng)是專業(yè)的生化器材網(wǎng)站,集生產(chǎn)、制造、銷售于一體。優(yōu)勢產(chǎn)品有紫外分析儀、核酸蛋白檢測儀、凝膠成像分析系統(tǒng)、低壓液相色譜分離儀、自動部分收集器、梯度混合器、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器等生物儀器,是銷售生化器材品種**,規(guī)模龐大的專業(yè)企業(yè)。 上海金鵬分析儀器有限公司 www.jp1718.com 電話: 61425398 36162366 手機: QQ:964122960,765695826, 842727501, 2460311703, 2431022418,170324176 傳真: 地址:上海市真陳路1398弄15號 郵編:200444