**定量PCR技術（real-timeimmuno-PCR）是把抗原抗體反應的高特異性和聚合酶鏈反應的高敏感性有機結(jié)合起來，其本質(zhì)是一種以PCR擴增一段DNA報告分子代替酶反應來放大抗原抗體結(jié)合率的一種改良型ELISA。

（1） real-time immuno-PCR的基本原理 real-timeimmuno-PCR主要由兩個部分組成：部分是類似于普通酶聯(lián)**吸附實驗（ELISA）的抗原抗體反應。**部分即熒光定量PCR。 Real-time immuno-PCR與ELISA的區(qū)別就在于ELISA是以堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶來標記抗體，用顏色反應來表明陽性或陰性結(jié)果，而前者是以一段特定的雙鏈或單鏈DNA來標記抗體，用PCR擴增抗體所連接的DNA，因此可由PCR產(chǎn)物的量來反映抗原分子的量。由于熒光定量PCR的高靈敏度，只要存在著極微量的抗原抗體反應，都能被檢測到。real-timeimmuno-PCR的關鍵之處就在于用一個連接分子將一段特定的DNA連接到抗體上，在抗原和DNA之間建立相對應關系，從而將對蛋白質(zhì)的定量檢測轉(zhuǎn)變?yōu)閷怂岬亩繖z測。

（2） real-time immuno-PCR體系的組成 **PCR體系由待檢抗原，特異性抗體，連接分子，DNA和PCR擴增系統(tǒng)組成。 1．待檢抗原：被檢測的樣品可以是抗原，或者是作為抗原的某種抗體。待檢的抗原可以直接吸附于固相，這一過程與ELISA試驗是相同的，因此有些吸附性差的抗原不能應用目前介紹的**PCR方法進行檢測，需要對**PCR進行改進，以便能夠檢測吸附性差的抗原。**PCR的后續(xù)過程需PCR擴增，目前有些方法應用的固相板或管是專門用于**PCR，并且有些PCR僅可以直接用微量板進行擴增，這樣可以簡化實驗過程和提高檢測的性。**PCR具有非常高的敏感性，特別適用于檢測微量抗原。 2．特異抗體：**PCR中的特異性是對應于待測抗原，與ELISA一樣，抗體的特異性和親和力將影響**PCR的特異性和敏感性。一般均選用單抗體，這個抗體常采用生物素標記，通過親和素再結(jié)合DNA。 3．DNA和PCR系統(tǒng)：**PCR中的DNA是一指示分子，用DNA聚合酶將結(jié)合于固相上的DNA特異放大，由此定量檢測抗原。**PCR的敏感性高于ELISA主要是借助了PCR強大的擴增能力。**PCR中的DNA分子可以選擇任何DNA，但要保證DNA的純度，且有較好的均質(zhì)性，盡可能不選用受檢樣品中可能存在的DNA。一般可選用質(zhì)粒DNA或PCR產(chǎn)物等。DNA的生物素化是用生物素標記的dATP或dUTP通過聚合酶標記在DNA分子上，一般是1個分子DNA標記2個生物素，標記率可達****。**PCR的PCR擴增系統(tǒng)與一般PCR一樣，主要包括引物、緩沖液和耐熱DNA聚合酶。 4．連接分子：連接分子是連接特異抗體與DNA之間的分子。Sano等用鏈親和素/蛋白A(striptavidin-proteinA)基因工程融合體作為連接分子來連接生物素標記的DNA與抗體，此種融合蛋白的鏈親和素部分可識別DNA上的生物素，蛋白部分可識別抗體的Fc段。

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