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近紅外漫反射光譜法測(cè)定青貯玉米品質(zhì)性狀的研究

白琪林^1,2 ，陳紹江 ¹ ，嚴(yán)衍祿 ³ ，朱雨杰 ⁴ ，戴景瑞 ¹

( ¹ 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)國(guó)家玉米改良中心，北京 100094； ² 山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物遺傳研究所，太原 030031；³ 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)信息與電氣工程學(xué)院，北京 100094； ⁴ 布魯克光譜儀器公司北京代表處，北京 100081)

摘要：【目的】研究利用近紅外漫反射光譜法（NIDRS）測(cè)定青貯玉米的體外干物質(zhì)消化率 (IVDMD)、中性洗滌纖維(NDF)、酸性洗滌纖維 (ADF)、粗蛋白（CP）和粗脂肪（EE）含量的可行性。【方法】以普通、高油和超高油玉米全株和秸稈的青貯樣為材料，采用光譜的主成分空間技術(shù)和偏*小二乘回歸法（PLS）。【結(jié)果】所建立的IVDMD、NDF、ADF、CP 和 EE 的校正模型的交叉驗(yàn)證決定系數(shù)( R2cv )分別為 0.9133、0.9764、0.9789、0.9254 和 0.7294，外部驗(yàn)證決定系數(shù)( R2val )分別為 0.8879、0.9455、0.9635、0.9387 和 0.7333，各項(xiàng)誤差(RMSEE、RMSECV 和 RMSEP)為 0.24(CP)～2.23(NDF)?！窘Y(jié)論】利用近紅外漫反射光譜法測(cè)定青貯玉米品質(zhì)性狀是完全可行的，該結(jié)果可滿足畜牧業(yè)對(duì)青貯飼料品質(zhì)快速分析的需要，對(duì)青貯玉米育種材料的快速鑒定篩選具有重要的意義。

關(guān)鍵詞：玉米；青貯；品質(zhì)性狀；近紅外漫反射光譜；校正模型

0 引言

【本研究的重要意義】青貯玉米具有較高的生物學(xué)產(chǎn)量和良好的飼料轉(zhuǎn)化效率，是草食家畜重要的飼料來(lái)源 [1] 。青貯可保持玉米青綠時(shí)的鮮嫩汁液，其植株經(jīng)過(guò)乳酸發(fā)酵后，質(zhì)地柔軟，具有酒香味，適口性好，且易消化吸收，是反芻動(dòng)物良好的粗飼料 [2] 。青貯玉米的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值主要取決于以下兩個(gè)方面：一是其體外干物質(zhì)消化率（in vitro dry matter digestion,IVDMD），二是其自身營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)。IVDMD 主要取決于秸稈中性洗滌纖維（neutral detergent fiber, NDF）、酸性洗滌纖維（acid detergent fiber, ADF）含量；營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)則與粗蛋白（crude protein, CP）和粗脂肪（etherextract, EE）等含量有關(guān)。青貯玉米 IVDMD 可以直接通過(guò)動(dòng)物飼喂試驗(yàn)和體外瘤胃發(fā)酵兩步法 [3] 進(jìn)行評(píng)價(jià)，但測(cè)定難度都很大，均存在費(fèi)力、耗時(shí)和費(fèi)用高等缺點(diǎn)。用傳統(tǒng)方法分析 NDF、ADF、CP 和 EE 含量，也存在測(cè)定速度慢、成本高，而且使用試劑有害的弊端。近紅外漫反射光譜（NIDRS）信息豐富，非常適合多組分測(cè)定，具有測(cè)定速度快，樣品制備簡(jiǎn)單，不耗費(fèi)化學(xué)試劑、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn) [4] 。因此研究利用NIDRS 快速、準(zhǔn)確測(cè)定青貯玉米品質(zhì)性狀的方法，對(duì)畜牧業(yè)發(fā)展和青貯玉米育種均具有十分重要的意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】NIDRS 是 20 世紀(jì) 80 年代后期迅速發(fā)展起來(lái)的一種技術(shù)，在國(guó)外已成為分析農(nóng)作物品質(zhì)的重要手段 [5~10] ，并廣泛應(yīng)用于玉米秸稈 NDF 與 ADF含量、IVDMD 和其它營(yíng)養(yǎng)成分的研究與評(píng)價(jià)上 [11~15] 。關(guān)于建立玉米青貯后品質(zhì)性狀的校正模型，國(guó)外類似工作很少，僅見(jiàn) Boever 等 [12] 用 NIDRS 預(yù)測(cè)全株玉米青貯后，其有機(jī)物（OM）、CP、NDF 和淀粉（STA）在牛體內(nèi)降解量模型的報(bào)道。國(guó)內(nèi) NIDRS 在玉米上應(yīng)用，也僅見(jiàn)用于測(cè)定籽粒品質(zhì)和秸稈品質(zhì) [16~19] ，尚未見(jiàn)有將之用于玉米青貯后品質(zhì)性狀的測(cè)定。 【本研究的切入點(diǎn)】上等青貯玉米育種的難點(diǎn)是缺乏快速可靠的實(shí)驗(yàn)室分析技術(shù)，不能很好地對(duì)玉米材料的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)進(jìn)行選擇鑒定 [20] 。由于目前國(guó)內(nèi)應(yīng)用 NIDRS 技術(shù)測(cè)定青貯玉米品質(zhì)尚屬空白，而青貯玉米育種和發(fā)展畜牧業(yè)又非常需要快速、準(zhǔn)確的 NIDRS 分析技術(shù)，因此進(jìn)行此項(xiàng)研究對(duì)中國(guó)青貯玉米育種和畜牧業(yè)的發(fā)展具有重要的促進(jìn)作用?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本文采用NIDRS 技術(shù)，在國(guó)內(nèi)**建立玉米青貯后 IVDMD 及其相關(guān)品質(zhì)性狀的 NIDRS 定量分析模型，期望解決青貯玉米品質(zhì)分析中繁瑣、耗時(shí)和費(fèi)力的問(wèn)題，為青貯玉米品質(zhì)育種提供快速分析測(cè)定的技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2003 年普通、高油和超高油玉米每一品種籽粒達(dá)乳線到 3/4 和 4/4 乳線期時(shí)，分別收獲帶穗整株玉米和不帶穗玉米秸稈，2004 年在以上 3 種玉米類型籽粒乳線達(dá)到 3/4 乳線期時(shí)，僅收獲玉米秸稈，以上樣品代表生產(chǎn)上帶穗青貯和不帶穗青貯兩種青貯玉米類型。其中，普通玉米籽粒含油量為 3%～4%，由普通系與普通系雜交而成；高油玉米籽粒含油量為 6%～10%，由高油系與普通系雜交而成；超高油玉米籽粒含油量一般超過(guò) 10%，由高油系與高油系雜交而成。樣品收獲后，盡快用青貯鍘草機(jī)切短，然后用錘式粉碎機(jī)粉碎，混勻后，取一定量樣品裝入 1000 ml 廣口瓶中，壓實(shí)，密封，分別制成帶穗青貯和不帶穗青貯兩類青貯樣品。隨后將樣品置于室內(nèi)，室溫下發(fā)酵60～90 d 后，開(kāi)瓶取樣，60℃恒溫下烘干，*后用9FQ-235 錘式粉碎機(jī)粉碎，過(guò) 40 目篩，分別裝入密封塑料袋中封口備用。以上帶穗整株青貯樣共 225 份，3/4 乳線期和 4/4 乳線期的秸稈青貯樣計(jì) 450 份，兩種類型樣品共計(jì) 675 份。其中，因取樣時(shí)期以及帶穗與否的不同，兩年之間所有樣品沒(méi)有重復(fù)的材料。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑 VECTOR22/N 傅里葉變換近紅外光譜儀（德國(guó) BRUKER 公司），以及配套 Quant 定量分析軟件，積分球附件，石英樣品杯。掃描范圍為4 000～12 000/cm，掃描次數(shù)為 64 次，分辨率為 8/cm。胃蛋白酶（1﹕1000，美國(guó) Jenview 公司）其余試劑為分析純。

1.2.2 近紅外光譜采集與標(biāo)樣的選取適量的青貯玉米樣品盛入直徑 50 mm 的旋轉(zhuǎn)樣品杯，用不銹鋼壓樣制樣器在樣品杯內(nèi)制樣，掃描樣品的近紅外光譜，每個(gè)樣品重復(fù)裝樣 3 次，取平均值進(jìn)行計(jì)算。同時(shí)利用光譜多維主成分特征的空間分布情況，從 675 份樣品中選擇標(biāo)樣，用來(lái)建立校正模型。

1.2.3 青貯樣品 IVDMD、NDF、ADF、CP 和 EE 的測(cè)定 樣品的IVDMD按體外瘤胃發(fā)酵兩步法測(cè)定，瘤胃液采自 4 頭裝有長(zhǎng)久瘤胃瘺管的荷斯坦閹公牛，NDF 與 ADF 按 Van Soest [21] 方法進(jìn)行測(cè)定，CP 和 EE分別按半微量凱氏法和油重法進(jìn)行測(cè)定，所有樣品均平行測(cè)定 3 次取均值，結(jié)果以干基（%）表示。

1.2.4 建立 NIDRS 數(shù)學(xué)模型的方法 建立 NIDRS模型的化學(xué)計(jì)量學(xué)方法是偏*小二乘（partial leastsquare, PLS）分析法。將樣品分為校正集和驗(yàn)證集，先用校正樣品集建立校正模型并作交叉驗(yàn)證，再用驗(yàn)證樣品集進(jìn)行外部驗(yàn)證，*后根據(jù) R 2 cal 、R 2 cv 、R 2 val RMSECV、RMSEP 等指標(biāo)確定*優(yōu)模型。采用OPUS/QUANT4.0 商用光譜定量分析軟件對(duì)模型進(jìn)行優(yōu)化，確定光譜預(yù)處理、譜區(qū)選擇和回歸統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品的選擇

由于全部 675 個(gè)試驗(yàn)樣品來(lái)自 2 個(gè)年度、不同品種類型和不同收獲期的全株青貯和秸稈青貯，數(shù)量很大，不可能全部進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室測(cè)定，為此對(duì)全部樣品的光譜矩陣進(jìn)行主成分分析，并從中選取了 150 個(gè)樣品作為建模樣品集（包括校正和驗(yàn)證集）。下圖為所有樣品的前兩個(gè)主成分得分（PCS）的分布圖，空心點(diǎn)表示選出的樣品，實(shí)心點(diǎn)表示未選樣品，由圖可見(jiàn)，所選取的150個(gè)樣品基本能涵蓋原來(lái)675個(gè)樣品的信息。

圖 主成分空間選擇代表性樣品

Fig. Selection of representative samples

2.2 樣品 IVDMD 及其化學(xué)成分的測(cè)定結(jié)果

根據(jù)各品質(zhì)性狀化學(xué)測(cè)定相對(duì)誤差大小，剔除部分相對(duì)誤差較大和個(gè)別界外點(diǎn)（outlier）樣品外，實(shí)際參與建模的青貯樣品數(shù)及測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表 1。由表 1可見(jiàn)，樣品 IVDMD 等性狀的變幅很大，基本上覆蓋了青貯玉米品種選育中可能出現(xiàn)的 IVDMD 等性狀的含量變化范圍，具有很好的樣本代表性，可以用于建立玉米青貯后品質(zhì)性狀的 NIDRS 校正模型。

2.3 IVDMD、NDF、ADF、EE 和 CP 數(shù)學(xué)模型的建立與優(yōu)化

本試驗(yàn)利用 OPUS/QUANT4.0 軟件，篩選青貯樣品的*佳建模光譜預(yù)處理方法、譜區(qū)范圍和主成分維數(shù)。通過(guò)交叉驗(yàn)證，比較不同光譜預(yù)處理方法與譜區(qū)范圍組合的交叉驗(yàn)證決定系數(shù)（R 2 cv ）、交叉驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)差（RMSECV）和校正決定系數(shù)（R 2 cal ）等參數(shù)，比較其結(jié)果，并確定青貯樣 IVDMD 等不同組分建立數(shù)學(xué)模型的*佳條件（表 2）。由表 2 可以看出，性狀不同，其*佳建模條件也各不相同。在此建模條件下，各性狀模型的決定系數(shù)*大，標(biāo)準(zhǔn)誤差*小。表 3 為利用以上建模條件的校正、驗(yàn)證結(jié)果。從表 3 可以看出，除 EE 含量外，各模型的校正決定系數(shù)和交叉驗(yàn)證決定系數(shù)均較高，且所有性狀的決定系數(shù)均達(dá)極顯著水平（P＜0.01）。IVDMD、NDF、ADF、CP 和 EE5 個(gè)校正模型的校正決定系數(shù)（R 2 cal ）為 0.9352～0.9843，校正誤差（RMSEE）為 0.24%～1.84%，交叉驗(yàn)證決定系數(shù)（R 2 cv ），為 0.9133～0.9789，交叉驗(yàn)證誤差（RMSECV）分別為 0.32%～2.06%。上述結(jié)果表明，所建模型的各項(xiàng)決定系數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差，已滿足農(nóng)業(yè)樣品對(duì)準(zhǔn)確度的要求。

2.4 青貯玉米品質(zhì)性狀校正模型預(yù)測(cè)效果分析

校正模型建立后，采用外部驗(yàn)證的方法，對(duì)所建模型實(shí)際預(yù)測(cè)效果進(jìn)行評(píng)價(jià)檢驗(yàn)，并對(duì)青貯樣品各性狀的預(yù)測(cè)值和化學(xué)值進(jìn)行成對(duì)數(shù)據(jù)雙尾 t 測(cè)驗(yàn)（表 4）。從表 4 可以看出，各性狀化學(xué)值與預(yù)測(cè)值間的 t 檢驗(yàn)值均未達(dá)到顯著水平，表明預(yù)測(cè)值與化學(xué)值間的差異不顯著。各性狀外部驗(yàn)證決定系數(shù)（R 2 val ）均達(dá)極顯著水平，R 2 val 除 EE 較小外，其余性狀為 0.8879～0.9635，預(yù)測(cè)誤差（RMSEP）為 0.26～2.23，各性狀預(yù)測(cè)值與化學(xué)值間平均偏差（Bias）為-0.09～0.30；IVDMD、NDF、ADF、CP 和 EE 驗(yàn)證集的預(yù)測(cè)值與化學(xué)值間的相關(guān)系數(shù) r 均達(dá)極顯著水平，r 分別為0.9433（IMDMD）、0.9730（NDF）、0.9818（ADF）、0.9694（CP）和 0.8668（EE），說(shuō)明二者存在較強(qiáng)的相關(guān)性。上述結(jié)果表明預(yù)測(cè)值與化學(xué)值比較接近，所建模型具有較高的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確度，可用來(lái)對(duì)未知樣品進(jìn)行實(shí)際預(yù)測(cè)。

3 討論

3.1 應(yīng)用 NIDRS 快速測(cè)定青貯玉米品質(zhì)性狀的可行性

目前，國(guó)內(nèi)已有用 NIDRS 測(cè)定玉米籽粒蛋白質(zhì)和淀粉含量的報(bào)道 [16] ，但迄今尚未見(jiàn)有用 NIDRS 測(cè)定玉米青貯品質(zhì)性狀的報(bào)道。與建立玉米籽粒品質(zhì)性狀的 NIDRS 校正模型相比，建立青貯玉米 IVDMD 及其相關(guān)品質(zhì)性狀校正模型的難度很大。究其原因，主要

是青貯樣品前處理程序多，首先要通過(guò)復(fù)雜的工序制作青貯樣，然后需長(zhǎng)時(shí)間的發(fā)酵、烘干、粉碎方能制好實(shí)驗(yàn)樣品。另外測(cè)定方法繁瑣費(fèi)時(shí)，干擾因素多，難以及時(shí)提供準(zhǔn)確分析數(shù)據(jù)。如實(shí)驗(yàn)室測(cè)定 IVDMD，主要是利用牛瘤胃液中的微生物來(lái)消化秸稈中的有機(jī)物和部分纖維素，因而需要飼養(yǎng)裝有長(zhǎng)久瘤胃瘺管的牛并取其瘤胃液，而且青貯樣品需在瘤胃液中厭氧條

件下發(fā)酵，同時(shí)還存在所取瘤胃液中的微生物因不同個(gè)體牛之間和因飼喂不同飼料造成的差異，從而影響測(cè)定的準(zhǔn)確性。由于 NIDRS 分析青貯玉米品質(zhì)性狀，樣品不需任何預(yù)處理，并具有快速、簡(jiǎn)便、廉價(jià)和多種成分同時(shí)測(cè)定的優(yōu)點(diǎn) [23] ，所以本試驗(yàn)以 NIDRS 技

術(shù)為基礎(chǔ)，建立了青貯玉米定量分析數(shù)學(xué)模型，簡(jiǎn)化了常規(guī)分析程序，較好地解決了青貯玉米常規(guī)分析方法難以解決的問(wèn)題。本試驗(yàn)所建立的 NIDRS 測(cè)定玉米整株和秸稈青貯的 IVDMD、NDF、ADF、EE 和 CP 含量的校正模型，除 EE 模型的交叉驗(yàn)證決定系數(shù)和外部驗(yàn)證決定系數(shù)較低外，IVDMD、NDF、ADF 和 CP 模型的交叉驗(yàn)證和外部驗(yàn)證決定系數(shù)可達(dá) 0.8879～0.9789，但各項(xiàng)誤差均較小（0.24～2.23）。Cozzolino 等 [14] 以整株普通玉米為樣品，建立了 CP、ADF 和 NDF 校正模型，其外部驗(yàn)證決定系數(shù)分別為 0.86（CP）、0.98（ADF）

和 0.83（NDF），預(yù)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)差分別為 1.04（CP）、1.85（ADF）和 2.43（NDF）。關(guān)于玉米青貯后所建立的品質(zhì)性狀校正模型，國(guó)內(nèi)外類似研究很少，報(bào)道不多。僅見(jiàn) Boever 等 [12] 用 NIRS 預(yù)測(cè)了 26 份全株普通玉米青貯后，其有機(jī)物（OM）、CP、NDF 和淀粉（STA）在牛體內(nèi)降解量模型的報(bào)道。這些模型外部驗(yàn)證決定系數(shù)分別為 0.72(OM)、0.79（CP）、0.52（NDF）和0.65（STA），預(yù)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)差分別為 3.4(OM)、0.30（CP）2.2（NDF）和 0.69（STA）。這表明，本試驗(yàn)所建立的 5 個(gè)青貯玉米品質(zhì)性狀定量分析模型，具有較高的質(zhì)量。此外，本實(shí)驗(yàn)所用的樣品數(shù)量大，類型多，有普通、高油和超高油玉米，還有不同收獲時(shí)期的樣品，因而具有很好的代表性。這 3 種類型的玉米青貯時(shí)，又包括帶穗全株青貯和秸稈青貯兩種方式，因而適配范圍更寬，將這些模型用于青貯玉米育種，可滿足大量青貯材料的篩選要求，并顯著提高其選育效率，也為生產(chǎn)上全株帶穗青貯和秸稈青貯對(duì)品質(zhì)快速分析體系的建立提供了重要的技術(shù)支持。

3.2 影響 NIDRS 分析準(zhǔn)確性的因素

NIDRS 作為一種間接測(cè)定技術(shù)，其分析準(zhǔn)確性受一些因素影響，其中受樣品因素的影響較大，如樣品中化學(xué)成分間的交互作用以及被測(cè)物質(zhì)成分濃度大小。本試驗(yàn)在建立青貯樣品粗脂肪 NIDRS 校正模型時(shí)，其交叉驗(yàn)證決定系數(shù)較小，為 0.7333。雖然在進(jìn)行粗脂肪測(cè)定時(shí)，全部測(cè)定均重復(fù) 3 次以上，測(cè)定相對(duì)誤差全部控制在 2%之內(nèi)，但建模結(jié)果仍不盡如人意。其原因主要是玉米秸稈纖維含量高，存在油和纖維的交互作用 [24] ，結(jié)果高纖維含量的成分掩蓋了低濃度或弱吸收脂肪的成分，因而所選擇的波長(zhǎng)對(duì)低濃度或弱吸收的成分缺乏敏感性。雖然青貯玉米樣品中粗脂肪含量變幅在 1.89%～8.24%，但由于存在這種交互作用，從而影響其測(cè)定的準(zhǔn)確度，這是青貯樣粗脂肪建模時(shí)交叉驗(yàn)證決定系數(shù)較低的可能原因。盡管如此，該模型仍基本上能滿足育種的實(shí)際需要。

3.3 關(guān)于模型的維護(hù)

近紅外光譜的分析基礎(chǔ)是數(shù)學(xué)模型。為提高近紅外光譜分析的**度與準(zhǔn)確度，本研究在建立玉米秸稈消化率及其相關(guān)品質(zhì)性狀的校正模型時(shí)，通過(guò)主成分空間技術(shù)對(duì)建模樣品進(jìn)行了挑選，同時(shí)進(jìn)行了適當(dāng)?shù)墓庾V預(yù)處理和譜區(qū)范圍的合理選擇，因而提高了模型的穩(wěn)定性。另一方面，本研究所建立起來(lái)的消化率及其相關(guān)品質(zhì)性狀的每一模型都有各自的適配范圍，如果今后待測(cè)定樣品本身的某性狀濃度超出了所建模型的適應(yīng)范圍時(shí)，就需要擴(kuò)大校正樣品集所覆蓋的范圍，在原有的模型中添加包含新信息的樣品 [11, 24] ，以保證其測(cè)定的準(zhǔn)確性。

4 結(jié)論

近紅外光譜法測(cè)定青貯玉米 IVDMD 等品質(zhì)性狀，不需要對(duì)樣品進(jìn)行復(fù)雜繁瑣的前處理，可同時(shí)分析多個(gè)組分，分析速度快，結(jié)果準(zhǔn)確，具有常規(guī)化學(xué)方法所不具有的優(yōu)點(diǎn)，因此利用近紅外漫反射光譜法測(cè)定青貯玉米品質(zhì)性狀是完全可行的，該結(jié)果可滿足畜牧業(yè)對(duì)青貯飼料品質(zhì)快速分析的需要，對(duì)青貯玉米育種材料的快速鑒定篩選具有重要意義。

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