熒光顯微鏡的原理
熒光顯微鏡的原理
在裝置上的重要部件就是要有能提供充分的特定波長(zhǎng)的光源裝置，使被檢物體得到理想的激發(fā)而發(fā)出強(qiáng)的熒光。為達(dá)到這一要求，均借助濾光片把激發(fā)光的光譜限定在這一特定波長(zhǎng)區(qū)域內(nèi)，而把伴隨時(shí)發(fā)出的可見(jiàn)光全部吸收或反射掉。
熒光顯微鏡的裝置有透射式和落射式兩種類型。
(一)透射式：激發(fā)光來(lái)自被檢物體的下方，聚光鏡為暗場(chǎng)聚光鏡，使激發(fā)光不進(jìn)入物鏡，而使熒光進(jìn)入物鏡。它在低倍情況下明亮，而高倍則暗，在油浸和調(diào)中時(shí)，較難操作，尤以低倍的照明范圍難于確定，但能得到很暗的視場(chǎng)背景。透射擊式不適用于非透明的被檢物件。
(二)落射式：新型的熒光顯微鏡多為落射式，在光路中具有分光鏡，光源是自被檢物體的上方，故對(duì)透明的被檢物體都適用。由于物鏡起到了聚光鏡的作用，不僅便于操作，而且從低倍到高倍，可以實(shí)現(xiàn)整個(gè)視場(chǎng)的均勻照明，但它在低倍情況下則暗，而高倍則明。
熒光顯微鏡的特殊結(jié)構(gòu)包括：
(一)濾色系統(tǒng)
濾色塊是熒光顯微鏡的重要部位，其核心部件由激發(fā)光濾色片(first barrier filter)、發(fā)射光濾色片(second barrier filter)和半透半反濾色片(beam-splitting mirror)組成。各廠家的濾色片型號(hào)、名稱常不統(tǒng)一。
1.激發(fā)光濾色片及發(fā)射光濾色片：根據(jù)光源和熒光色素的特點(diǎn)，通常選用以下三類配套，提供一定波長(zhǎng)范圍的激發(fā)光，并使樣品激發(fā)出的熒光透過(guò)，到達(dá)目鏡成像。
紫外光激發(fā)：激發(fā)光濾色片可使紫外光透過(guò)，阻擋400nm以上的可見(jiàn)光通過(guò)。與之相應(yīng)的發(fā)射光濾色片可允許藍(lán)光通過(guò)，視野內(nèi)的光呈藍(lán)色，如應(yīng)用于DAPI染色。
藍(lán)光激發(fā)：激發(fā)光濾色片可使藍(lán)光通過(guò)，阻擋其他波段的光。與之相應(yīng)的發(fā)射光濾色片可允許綠光通過(guò)，如GFP 染色標(biāo)記。
綠光激發(fā)：激發(fā)光濾色片使綠光通過(guò)，阻擋其他波段的光。與之相應(yīng)的發(fā)射光濾色片通?？稍试S紅光通過(guò)，如Rhodamine染色。
2.半透半反濾色片：它的作用是完全阻擋激發(fā)光通過(guò)，而將其反射;并透過(guò)相應(yīng)波長(zhǎng)范圍的發(fā)射光。其型號(hào)與激發(fā)光濾色片和發(fā)射光濾色片相對(duì)應(yīng)。
(二)物鏡及目鏡
各種物鏡基本可以應(yīng)用，但*好選用增稱、消色差的物鏡，因其自體熒光極微且透光性能(波長(zhǎng)范圍)適合于熒光。由于圖像在顯微鏡視野中的熒光亮度與物鏡鏡口率的平方成正比，而與其放大倍數(shù)成反比，所以為了提高熒光圖像的亮度，應(yīng)使用鏡口率大的物鏡。尤其對(duì)熒光不夠強(qiáng)的標(biāo)本，應(yīng)使用鏡口率大、光透過(guò)性高的物鏡，配合以盡可能低倍的目鏡。
(三)其他光學(xué)裝置
反光鏡，其反光層一般是鍍鋁的，因?yàn)殇X對(duì)紫外光和可見(jiàn)光的藍(lán)紫區(qū)吸收少，反射達(dá)90%以上(而銀的反射率只有70%)。一般使用平面反光鏡。聚光鏡，專為熒光顯微鏡設(shè)計(jì)制作的聚光鏡用石英玻璃或其他透紫外光的玻璃制成。落射光裝置，它除具有透射式光源的功能外，更適用于不透明及半透明標(biāo)本，如厚片、濾膜、菌落、組織培養(yǎng)等樣品的直接觀察。近年研制的新型熒光顯微鏡多采用落射光裝置，稱之為落射熒光顯微鏡。
(四)光源
現(xiàn)在多采用50或100W的高壓汞燈作光源。工作時(shí)由兩個(gè)電極間放電，引起水銀蒸發(fā)，球內(nèi)氣壓迅速升高(這一過(guò)程一般約需要5～15min)，并在這一過(guò)程中發(fā)射光量子，釋放的光的波長(zhǎng)足以激發(fā)各類熒光物質(zhì)，因此，為熒光顯微鏡普遍采用。
汞燈的使用壽命較短，通常為200hrs，針對(duì)這種使用壽命上的限制，近幾年，一種新型熒光光源X-Cite以2000hrs超長(zhǎng)的燈泡壽命，及靈活的使用——無(wú)需預(yù)熱，即開(kāi)即用而被廣泛使用。