ATP熒光檢測技術(shù)介紹（3）-ATP熒光檢測儀技術(shù)文章
1. 常見的ATP分析方法。
根據(jù)ATP與其所含雜質(zhì)理化性質(zhì)的差異，發(fā)展起來很多分析方法，歸納起來主要有層析法、電泳法和光學(xué)分析法。光學(xué)分析法中ATP試劑盒法和生物發(fā)光法能夠選擇性檢出ATP，不必對ATP進(jìn)行分離。層析法和電泳法則為先分離后檢出。后二者能同時提供更詳細(xì)的雜質(zhì)的信息。
一．層析法
當(dāng)各組分的分配系數(shù)及親和力存在一定差異時，可以通過層析法將其一一分離。ATP的層析分析方法主要有紙層析法、薄層層析法、離子交換柱層析法和高效液相色譜法。
1. 紙層析法
紙層析方法測定ATP含量是生化試劑核苷酸含量測定的通用方法，其常用的展開劑組成為異丙醇+濃氨水+ 水（7:1:2）。對于一些定性分析，也可以直接用顯色劑顯色觀察結(jié)果。
2. 薄層層析法
薄層層析法與紙層析法一樣，是生化試劑核苷酸含量測定的通用方法。該方法通常以正丁醇+ 丙酮+冰乙酸+5%氨水+ 水（7:5:3:3:2）為展開劑，點(diǎn)樣量20ug,，在以硅膠GF為吸附劑的薄板上展層。層析完畢后，于50℃干燥，紫外光下觀察吸收斑點(diǎn)。
3. 離子交換柱層析法
核苷酸是兩性化合物，不同的核苷酸的電離常數(shù)（pK）和由此得到的等電點(diǎn)存在差異。當(dāng)介質(zhì)的pK值不同時，其所帶的凈電荷也會不同。pK值高于5時，所有的核苷酸都會帶負(fù)電荷，會被陰離子樹脂吸附，因此可以采用分步降低pK值或分步增加陰離子濃度的方法將不同的核苷酸依次洗脫下來。檢測洗脫液A260，將之與洗脫液體積作圖，便能得到ATP的分析結(jié)果.
這也是目前工業(yè)生產(chǎn)和一些實(shí)驗(yàn)室中制備ATP的方法.
4. 高效液相色譜法
ATP與其主要雜質(zhì)AMP和ADP的*大紫外吸收峰位于相同的波長處，且摩爾吸光系數(shù)相同。劉克江等人利用該原理采用UV-HPLC法檢測了ATP片劑，得到了良好的結(jié)果。
二．電泳法
核苷酸分子上既帶有堿性基團(tuán)，又帶有酸性基團(tuán)。在一定條件下，通過荷電核苷酸分子特性的差異，可以用電泳法將不同的核苷酸分離開來。依據(jù)支持介質(zhì)及技術(shù)上的差異來劃分，見諸報道的ATP電泳分析方法主要有紙電泳法、醋酸纖維薄膜電泳法、瓊脂糖凝膠電泳法和毛細(xì)管電泳法。
1. 紙電泳法
該方法采用紙電泳將ATP與雜質(zhì)分離，紫外分光光度計測定分離出的ATP的吸收值，計算其含量。
2. 醋酸纖維薄膜電泳法
早期的醋酸纖維薄膜電泳法采用了與紙電泳類似的實(shí)驗(yàn)路線，仍然要通過電泳、干燥、描斑點(diǎn)、洗脫、測吸光度值等步驟來測定ATP的含量，程序繁雜。為避免這種情況，張若燕在測定了市售ATP注射液中ATP的含量時，直接采用薄層掃描儀進(jìn)行掃描測定，解決了ATP分離后還需洗脫的麻煩，獲得了與部頒標(biāo)準(zhǔn)法一致的結(jié)果。
3. 瓊脂糖凝膠電泳法
為了簡單快速地測定ATP含量，邱蔚然等人設(shè)計了瓊脂糖凝膠電泳法：在特種平板玻璃上，以瓊脂糖做支持介質(zhì)，以0.05mol/L、pH3.5 的檸檬酸溶液做緩沖溶液，在40V/cm電壓梯度下電泳5min,實(shí)現(xiàn)了ATP與其它雜質(zhì)的有效分離，測得了ATP含量.
4. 毛細(xì)管電泳法
采用毛細(xì)管的區(qū)帶電泳技術(shù)（CZE），克服了傳統(tǒng)區(qū)帶電泳的熱擴(kuò)散和樣品擴(kuò)散問題，使分析靈敏度有了很大提高，分離效率可達(dá)到百萬塊塔板數(shù)。而將電泳原理和色譜法相結(jié)合的毛細(xì)管膠束電動色譜（CMEC），還解決了電泳法不能分離中性物質(zhì)的缺陷。
在建立電泳分析方法中，改進(jìn)或?qū)ふ腋玫碾娪局С纸橘|(zhì)，將有助于提高ATP, 分析的分辨率；采用適當(dāng)?shù)姆蛛x方法與檢測方法搭配將有利于減少工作步驟，提高分析數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。
三．光學(xué)分析法
腺苷酸的腺嘌呤堿基上存在共扼的雙鍵，因此AMP、ADP、ATP在紫外區(qū)均有吸收峰，且其*大吸收峰位于相同的波長處，因此可以用紫外分光光度法檢測其含量。此外它們在酸性條件下與??乙醛水合三聚體反應(yīng)，可產(chǎn)生穩(wěn)定的強(qiáng)烈熒光，核酸的其它堿基及鳥嘌呤、尿嘧啶、胸腺嘧啶等對此反應(yīng)不發(fā)生干擾，藉此可以建立熒光分析法選擇性測定混合物中的腺嘌呤及其衍生物。但由于無法區(qū)分不同的腺苷酸，在ATP分析中，它們往往被作為*終的檢測方法與ATP, 的分離方法配合使用。特別地，通過與一些試劑的選擇性反應(yīng)，ATP可以被單獨(dú)檢出，新發(fā)展起來的ATP試劑盒法和生物發(fā)光法在這方面顯示了獨(dú)特的優(yōu)越性。
1. ATP試劑盒法
磷酸甘油激酶催化ATP 和3-磷酸甘油酯之間的反應(yīng)時，伴隨有還原型NADH生成氧化型NAD，此過程溶液的吸光度在340nm處有變化，此吸光度變化與ATP濃度有相應(yīng)的線性關(guān)系。據(jù)此美國的SIGMA公司生產(chǎn)了ATP試劑盒，使用它可以將ATP選擇性定量檢出。
2. 生物發(fā)光法
生物發(fā)光法是Mcelroy等首先引入的。此方法所依據(jù)的原理是：在熒光素酶和Mg2+的作用下，熒光素與ATP發(fā)生腺苷酰化被活化，活化后的熒光素與熒光素酶相結(jié)合，形成熒光素-AMP復(fù)合體，放出焦磷酸(PPi)。該復(fù)合體被分子氧氧化，導(dǎo)致熒光素產(chǎn)生電激發(fā)，放出CO2和H2O，當(dāng)熒光素從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時發(fā)射光。*后L-AMP脫離酶，形成熒光素L和AMP。反應(yīng)所產(chǎn)生的光和AMP含量成正比，根據(jù)發(fā)光的強(qiáng)弱就可以選擇性定量測定AMP的含量。
生物發(fā)光法作為一種簡便、快速的微生物檢驗(yàn)方法和食品生產(chǎn)環(huán)境潔凈度的檢測方法，近年來在國內(nèi)外倍受注目，并得以廣泛應(yīng)用。日本東亞電波工業(yè)公司研制的ATP測定儀AF-100可以在40s內(nèi)完成測定。目前，日本應(yīng)用生物發(fā)光法原理生產(chǎn)微生物檢測用器材的廠家已有6家。
表1 各類ATP分析法比較
| 方法 | 原理 | 優(yōu)點(diǎn) | 缺點(diǎn) |
| 紙層析法 | 層析分離后檢測 | 技術(shù)成熟，操作簡便 | 操作時間長，精度低 |
| 薄層層析法 | 層析分離后檢測 | 技術(shù)成熟，操作簡便 | 精度低 |
| 離子交換柱層析法 | 層析分離后檢測 | 可大量制取ATP | 操作時間長，精度低 |
| 高效液相色譜法 | 色譜分離后檢測 | 操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確 | 儀器昂貴 |
| 紙電泳法 | 層析分離后檢測 | 技術(shù)成熟 | 操作繁瑣，耗時長 |
| 醋酸纖維薄膜電泳法 | 層析分離后檢測 | 電泳時間短，檢測便捷 | 需要薄層掃描儀 |
| 瓊脂糖凝膠電泳法 | 電泳分離后檢測 | 電泳時間短 | 精度低 |
| 毛細(xì)管電泳法 | 色譜分離后檢測 | 快速、便捷、精度高 | 儀器昂貴 |
| ATP試劑盒法 | 選擇性檢出 | 操作簡單，精度高 | 未分析雜質(zhì) |
| 生物發(fā)光法 | 選擇性檢出 | 操作簡單，結(jié)果準(zhǔn)確 | 未分析雜質(zhì) |
3. ATP熒光檢測法的原理
ATP即三磷酸腺苷，是高能磷酸化合物，它是由一份子腺嘌呤，一分子核糖和三個相鄰的磷酸集團(tuán)構(gòu)成的核苷酸。
ATP存在于所有有機(jī)體中，為活細(xì)胞提供能量
ATP生物發(fā)光技術(shù)的原理是熒光素酶（Luciferase）以熒光素（Luciferin）、三磷酸腺苷（ATP）和O2為底物，在Mg2＋存在時，能將化學(xué)能轉(zhuǎn)化為光能。ATP既是熒光素酶催化發(fā)光的必需底物，又是所有生物生命活動的能量來源。
Luciferin +ATP+O2 Oxy-Luciferin+AMP+PPi+H2O+hv
在一定的ATP濃度范圍內(nèi)，此反應(yīng)所釋放出的光強(qiáng)度與體系中存在的ATP數(shù)量成良好的線性關(guān)系。因?yàn)槿姿嵯佘?ATP)存在于所有的活體細(xì)胞中，并且各生長期的**都還含有較恒定的ATP 量，因此這可以作為一種活體細(xì)胞的指示劑，通過ATP生物發(fā)光法檢測出ATP數(shù)量，并由此推算出體系中**的數(shù)量。與傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)法相比，這種方法能快速得到結(jié)果，并且操作者無需技術(shù)，方法簡便易懂，更容易被普通人群接受，而平板培養(yǎng)法所需時間較長，通常需要培養(yǎng)24-48 h，才能得到*終結(jié)果，并且對操作者的技術(shù)要求較高，操作復(fù)雜。但ATP生物發(fā)光法有其局限性，由于不同種類**所含的ATP量不同，并且同一種類**，ATP含量也隨**的細(xì)胞大小，健康狀況、生長階段和生長環(huán)境不同而不同[1]，因此ATP生物發(fā)光法檢測**無法反應(yīng)**種類，也無法**顯示**數(shù)量。但生物發(fā)光法無需培養(yǎng)過程，操作簡便、靈敏度高，數(shù)分鐘內(nèi)即可得到結(jié)果，具有其他微生物檢測方法無法比擬的優(yōu)勢，是目前檢測微生物*快的方法。
ATP生物發(fā)光技術(shù)主要包括以下幾個步驟：擦拭物體表面取樣，菌體細(xì)胞與ATP提取劑作用提取出ATP，ATP與熒光素酶-熒光素體系反應(yīng)，用特定檢測儀測定發(fā)光值，通過發(fā)光值得到ATP量并推算出**數(shù)量?，F(xiàn)在市場上已出現(xiàn)各種基于ATP生物發(fā)光技術(shù)用于快速檢測微生物的產(chǎn)品，但是這些自成體系的檢測系統(tǒng)，通過其檢測儀所得到的相對發(fā)光值不具有可比性，除非通過ATP標(biāo)準(zhǔn)曲線將相對發(fā)光值轉(zhuǎn)化成ATP量，才可進(jìn)行比較。
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