ATP生物冷光反應(yīng)技術(shù)應(yīng)用在生乳生菌數(shù)之快速檢測
王中奇(1)(2) 任志正(1)
收件日期：87年12月19日；接受日期：88年2月4日
摘要：將生乳的生菌數(shù)以傳統(tǒng)平板計(jì)數(shù)與ATP生物冷光反應(yīng)對同一乳樣所測得之相對吸光值（relative light unit, RLU），求出兩者對數(shù)值間的線性關(guān)係。利用此一迴歸方程式的標(biāo)準(zhǔn)曲線，可對生乳生菌數(shù)進(jìn)行快速估算，全程費(fèi)時6分鐘。所得之迴歸方程式y(tǒng)＝1.29x＋2.06（n＝62），其相關(guān)係數(shù)為0.87（P＜0.05＝，顯示傳統(tǒng)平板計(jì)數(shù)生菌數(shù)與ATP生物冷光反應(yīng)之RLU值有良好的相關(guān)性。此結(jié)果顯示可應(yīng)用ATP生物冷光反應(yīng)技術(shù)快速估算生乳之生菌數(shù)，並可用此技術(shù)取代傳統(tǒng)的美藍(lán)試驗(yàn)檢測生乳菌數(shù)，讓乳品製造業(yè)者能快速地了解原料的品質(zhì)，以利後段加工的進(jìn)行。（關(guān)鍵語：生乳、ATP生物冷光反應(yīng)、美藍(lán)還原試驗(yàn)）
(1)食品工業(yè)發(fā)展研究所。
(2)Corresponding author.
緒 言
ATP生物冷光反應(yīng)技術(shù)（ATP bioluminescence technique）是一種快速檢測方法，用以檢測ATP的含量。此法為美國太空總署於1960年代發(fā)展出來的技術(shù)（Griffiths, 1996），其反應(yīng)原理與螢火蟲體發(fā)光反應(yīng)相同，在螢光素（luciferin）與螢光素（luciferase）存在下，使ATP與螢光素及螢光素作用產(chǎn)生螢光（Kricka, 1988）。其反應(yīng)方程式如下所示：
美國太空總署當(dāng)初發(fā)展此項(xiàng)技術(shù)的目的，是希望能用以檢測外太空是否有生命物質(zhì)存在，然近來生物冷光反應(yīng)卻在食品與醫(yī)藥領(lǐng)域中被使用。ATP廣泛存在於地球上的各類生物體中，除了微生物體內(nèi)，食品中亦有多量的ATP。以細(xì)菌而言，一個菌體內(nèi)ATP含量約為10-18M；**類菌體因體積較大，一個細(xì)胞則含10-15～10-16M。目前ATP生物冷光儀檢測ATP含量的極限約是10-12M，換言之，欲檢測細(xì)菌類的微生物，菌數(shù)需超過103 CFU/ml，機(jī)器才能檢出（山本，1997）。
應(yīng)用此種技術(shù)檢測食品中生菌數(shù)時，需先將食品中非微生物的ATP水解（Griffiths, 1993），再將微生物體內(nèi)的ATP釋放出來，與酵素反應(yīng)，*後以ATP生物冷光儀檢測。倘若欲檢測食品接觸表面的清潔度，則無需去除食品中的ATP，直接測量即可。檢測結(jié)果則以相對吸光值（relative light unit, RLU）的多寡來表示ATP濃度的高低，藉此反推微生物含量和可能的食物殘留，以表示食物接觸面清潔度的情況。
目前ATP生物冷光反應(yīng)技術(shù)已廣泛地應(yīng)用在各項(xiàng)食品產(chǎn)業(yè)，包括生乳生菌數(shù)估算（Giese, 1997）、設(shè)備清潔度的評估（任等，1998；Seeger and Griffiths, 1994）及成品架售期的推估（Phillips and Griffiths, 1985），畜產(chǎn)業(yè)中屠體的污染評估（Siragusa et al., 1995），果汁產(chǎn)業(yè)的菌數(shù)估算（Graumlich, 1985）、製酒工業(yè)及飲料業(yè)等（王等，1998；Tydrich, 1996）。
鮮乳的營養(yǎng)價(jià)值很高，是人體鈣質(zhì)等各類營養(yǎng)素*佳的來源，也因?yàn)槿槠返母郀I養(yǎng)價(jià)值，不適當(dāng)?shù)募榛蛸A藏條件常造成生乳的生菌數(shù)過高，因而影響鮮乳的風(fēng)味與品質(zhì)。業(yè)者雖了解生乳生菌數(shù)會影響成品的品質(zhì)，然一般傳統(tǒng)微生物檢測法需耗時兩天，當(dāng)?shù)弥槠焚|(zhì)時，乳品早已加工至成品階段，甚至被消費(fèi)者飲用完畢；目前，雖有部份工廠使用快速檢測方法測定生乳生菌數(shù)之方法，但大部份乳品工廠所使用的美藍(lán)還原試驗(yàn)（methylene blue reduction test）需費(fèi)時八小時，無法配合生產(chǎn)時效需求；其準(zhǔn)確性亦常受光線、含氧量與操作技術(shù)等因子的影響（李等，1988），造成生乳計(jì)價(jià)時的困擾。
本實(shí)驗(yàn)是以ATP生物冷光反應(yīng)技術(shù)應(yīng)用於生乳生菌數(shù)的快速檢測，期望能以ATP生物冷光儀所測得的RLU值，利用化學(xué)檢測取代微生物檢測，快速地估算出生乳的生菌數(shù)，並配合美藍(lán)還原試驗(yàn)，比較生乳生菌數(shù)、RLU值與美藍(lán)還原試驗(yàn)結(jié)果，用以評估ATP生物冷光反應(yīng)在生乳生菌數(shù)檢測之適用性。
材料與方法
一. 試樣的製備
依據(jù)農(nóng)委會於86年11月生乳計(jì)價(jià)會議所得之草案資料，在生乳生菌數(shù)部份，生乳計(jì)價(jià)的菌數(shù)分級是每毫升乳樣在10萬至120萬個生菌數(shù)間，分成七組。本實(shí)驗(yàn)生乳乳樣由臺灣北部與中部酪農(nóng)戶取得，乳樣生菌數(shù)多分布在104～105 CFU/ml左右，若以本實(shí)驗(yàn)所取得之乳樣進(jìn)行試驗(yàn)，其生菌數(shù)均接近在105 CFU/ml上下，無法得到充分的數(shù)據(jù)供應(yīng)迴歸方程式的運(yùn)算。經(jīng)考慮生乳品質(zhì)低下的原因，除集乳設(shè)備與環(huán)境污染外，多為貯藏溫度與時間不當(dāng)所造成。為設(shè)計(jì)出適合本研究不同範(fàn)圍的生乳生菌數(shù)含量，有的乳樣直接檢測，有的乳樣經(jīng)過12～24小時，在較高溫（8～16℃）的暴露，預(yù)期找到生乳生菌數(shù)ATP含量範(fàn)圍相對應(yīng)之生菌數(shù)可至120萬/ml以上，再進(jìn)行生乳乳樣檢測（包括生乳生菌數(shù)檢測、生物冷光反應(yīng)RLU檢測及美藍(lán)還原試驗(yàn)）。
二. 生乳生菌數(shù)的檢測
生菌數(shù)的測定方法是將生乳乳樣經(jīng)系列稀釋後，取1 ml置於3 M薄膜試劑（3M petrifilm, 3M Health Care, St. Paul, U.S.A）上，以壓板壓平後，於37℃下培養(yǎng)48 hr後計(jì)數(shù)。
三. 生乳生物冷光反應(yīng)RLU值檢測
生乳生物冷光反應(yīng)之RLU值測定操作步驟如下：以LUMAC公司生產(chǎn)之Celsis Lumacâ milk bacteria kit為試驗(yàn)藥劑，乳樣及藥劑均以微量吸管（Pipetman, Gilson, France）吸取。取待測生乳乳樣50m l置於lumacuvette中，加入80m l NRS（可釋出食品中非微生物的ATP），再加入20m l Somase（水解ATP的酵素，可分解添加NRS後所釋出食物中之ATP）後於室溫下震盪5 min，然後加入100m l L-NRB（用以釋出活的微生物細(xì)胞內(nèi)之ATP），30 sec後再加入Lumit-PM（含有螢光素，可與ATP作用產(chǎn)生螢光??，*後以ATP生物冷光儀（Celsis lumac biocounter M2500, Landgraaf, Netherland）讀取RLU值（Anonymous, 1997）。
四. 生乳生菌數(shù)與其ATP冷光反應(yīng)RLU值之標(biāo)準(zhǔn)曲線製作
首先製作生乳生菌數(shù)的檢量線，分批檢測生乳乳樣，這些樣品的生菌數(shù)*好能均勻的分布在104～107之CFU/ml間，每個乳樣以3M薄膜試劑檢測生乳之生菌數(shù)，同時並應(yīng)用ATP生物冷光反應(yīng)儀測定生乳RLU值，將所得生菌數(shù)與RLU值結(jié)果（n＝62）分別取對數(shù)值後，以SAS軟體（Snedecor and Cochran, 1980%