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技術(shù)**

基因組學(xué)邁向蛋白質(zhì)組學(xué)的橋梁
體外表達(dá)（一）：基因組學(xué)邁向蛋白質(zhì)組學(xué)的橋梁 
前言 
隨著測(cè)序技術(shù)、PCR和RT-PCR技術(shù)、芯片技術(shù)和RNA干擾技術(shù)的突飛猛進(jìn)，人們對(duì)核酸的信息了解得越來越多?？墒?，生命終是以蛋白質(zhì) 形式行使功能的，因此對(duì)蛋白質(zhì)功能的研究才是生命科學(xué)真正的“重頭戲”。對(duì)蛋白質(zhì)功能的研究大體上有幾個(gè)思路，其一：從DNA水平上敲掉它，或者在基因表達(dá)過程中沉默它（也就是我們常說的RNA干擾），看看缺失基因或者上調(diào)下調(diào)這個(gè)蛋白基因的表達(dá)水平對(duì)生命過程有何影響從而推測(cè)其功能，這類方法大多屬于逆向思路；其二就是分離純化蛋白質(zhì)，研究其基本特性，直接在蛋白水平進(jìn)行研究——要掌握一個(gè)蛋白質(zhì)，不要隔靴搔癢，這應(yīng)該是必經(jīng)的一步。我們甚至有理由相信，不遠(yuǎn)的將來，直接用純化蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在細(xì)胞水平上觀察蛋白質(zhì)對(duì)細(xì)胞的影響，也會(huì)成為類似RNA干擾一樣重要研究工具，蛋白質(zhì)干擾。由于蛋白質(zhì)極為復(fù)雜的折疊和加工形式?jīng)Q定了不同蛋白的性質(zhì)和活性存在的差異，蛋白質(zhì)相比起核酸來說，無論制備、純化、存儲(chǔ)、操作都困難得多，因此目前大多數(shù)研究仍集中于核酸水平進(jìn)行研究。但是，核酸研究終不可能取代蛋白質(zhì)研究，隨著科研水平不斷的提高，直接對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行研究必將成為大勢(shì)所趨。率先把握未來的方向，就能快人一步！您開始準(zhǔn)備了嗎？生物通為您準(zhǔn)備了大量的資料，一一講解個(gè)中優(yōu)劣。 
“快”就一個(gè)字 
以往，要獲得蛋白樣品，方法之一是通過收集大量的生物材料純化。受限于材料的來源有太多的限制——特別是人的組織來源，很多人轉(zhuǎn)而采用另一種方法：重組表達(dá)的方式獲得蛋白——選擇合適的表達(dá)系統(tǒng)，將DNA克隆到合適的表達(dá)載體中，通過轉(zhuǎn)化或者轉(zhuǎn)染到原核或者真核細(xì)胞中，篩選單克隆轉(zhuǎn)化子，摸索表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化。經(jīng)過一番費(fèi)時(shí)艱苦的工作并建立穩(wěn)定的表達(dá)體系后，獲得單克隆就可比較穩(wěn)定地進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)。利用真核或原核細(xì)胞表達(dá)目的蛋白，大的困擾就是耗時(shí)：比如如何選擇合適的表達(dá)系統(tǒng)——由于表達(dá)外源蛋白必然會(huì)在不同程度上干擾細(xì)胞自身的代謝，不同的蛋白可能需要不同的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞，以及需要摸索不同的表達(dá)條件和培養(yǎng)條件，否則可能表達(dá)不出結(jié)果。這個(gè)選擇是非常令人**、費(fèi)時(shí)費(fèi)力的過程。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展，采用這種手段進(jìn)行研究在速度上已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足需要了。試想，當(dāng)DNA純化、PCR、克隆都已經(jīng)可在96孔板或者384孔板上成批成批地高速度高通量自動(dòng)化完成時(shí)，當(dāng)一張小小的芯片已經(jīng)可完成數(shù)以萬計(jì)甚至更多的基因的檢測(cè)的時(shí)候，卻依然受限于一個(gè)一個(gè)基因的轉(zhuǎn)化或者轉(zhuǎn)染，然后在一個(gè)一個(gè)地篩選成功轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化子，摸索表達(dá)條件——這就好比一條川流不息的高速公路上突然收窄為小小的獨(dú)木橋！多郁悶??！于是人們不得不開始尋找提速之旅。既然利用細(xì)胞表達(dá)有太多的因素干擾，無細(xì)胞體外表達(dá)就重新成為人們關(guān)注的目標(biāo)。 
體外表達(dá)早已有，本不算什么新鮮事兒。借助聚合酶體外轉(zhuǎn)錄PCR產(chǎn)物，可很簡(jiǎn)單高產(chǎn)地獲得足量的mRNA，甚至戴上真核mRNA特有的“帽子”；加入特定的細(xì)胞裂解物，利用其中的核糖體、合成酶、tRNA、**起始、延伸、終止因子、氨基酸等等蛋白質(zhì)合成的必需元件，在適合的溫度下就可體外合成蛋白質(zhì)。 
相比之下，體外表達(dá)大的優(yōu)勢(shì)就是快與靈活方便——如果你希望時(shí)間鑒別基因產(chǎn)物、早出paper早畢業(yè)，而不是生產(chǎn)，干嗎要浪費(fèi)幾個(gè)星期去建立一套表達(dá)系統(tǒng)呢？體外表達(dá)是更快速簡(jiǎn)單的選擇，快只要幾個(gè)小時(shí)就看到結(jié)果了。老實(shí)說，后究竟能有幾個(gè)研究的表達(dá)體系有機(jī)會(huì)進(jìn)入生產(chǎn)環(huán)節(jié)？何況實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞株、培養(yǎng)發(fā)酵條件和工業(yè)相差還遠(yuǎn)呢！再說，就表達(dá)量而言，通常認(rèn)為體外表達(dá)量低，如今不少體外表達(dá)體系已經(jīng)可達(dá)到每毫升每小時(shí)反應(yīng)體系數(shù)百微克的水平，媲美普通的哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)，滿足一般研究需要。 
過去，傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)研究注重研究單一蛋白質(zhì)，今天，蛋白質(zhì)組學(xué)注重研究參與特定生理或病理狀態(tài)的所有的蛋白質(zhì)種類及其與周圍環(huán)境(分子)的關(guān)系。蛋白質(zhì)組學(xué)相關(guān)研究工具通常都是高通量、高度自動(dòng)化的系統(tǒng)，速度快，配合相應(yīng)分析軟件和數(shù)據(jù)庫，研究者可在短的時(shí)間內(nèi)處理多的數(shù)據(jù)。體外表達(dá)大的優(yōu)勢(shì)就是快與靈活，由于突破了細(xì)胞的限制，整個(gè)實(shí)驗(yàn)可設(shè)計(jì)為自動(dòng)化操作，甚至在不遠(yuǎn)的將來有可能進(jìn)行高通量快速篩選，可說，體外表達(dá)是從高通量基因組研究邁向蛋白組研究的相當(dāng)關(guān)鍵的一步。試想，從PCR到體外表達(dá)到蛋白純化都可高通量進(jìn)行，做起實(shí)驗(yàn)來該有多爽！ 
對(duì)比起體內(nèi)表達(dá)，體外表達(dá)主要快在以下兩個(gè)地方： 
1 可采用全PCR方式 
體內(nèi)表達(dá)往往都是需要將目的基因插入環(huán)狀載體，或者是插入病毒載體，就算你實(shí)驗(yàn)室牛到感受態(tài)都不用自己做，還是要等**長個(gè)overnight，然后挑克隆鑒定。真核細(xì)胞就需要更長時(shí)間了。可是，利用體外表達(dá)，除了利用載體克隆，更快速的選擇是——你只要在PCR時(shí)兩端加上不同的啟動(dòng)子序列就可得到體外表達(dá)的模版材料了。 
2 不利用細(xì)胞表達(dá) 
利用細(xì)胞表達(dá)需要培養(yǎng)細(xì)胞、轉(zhuǎn)化或者轉(zhuǎn)染、挑選單克隆，還要培養(yǎng)細(xì)胞做表達(dá)。表達(dá)時(shí)由于影響的因素較多，需要摸索的條件也多。體外表達(dá)突破了細(xì)胞的限制，體外表達(dá)不需要花時(shí)間轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)染細(xì)胞、也不需要篩選重組克隆，也不需要培養(yǎng)細(xì)胞，只需幾個(gè)小時(shí)就可得到產(chǎn)物，大大節(jié)約了時(shí)間和精力，在快速鑒別基因產(chǎn)物上就格外有優(yōu)勢(shì)。此外，體外表達(dá)還可避免過量表達(dá)對(duì)細(xì)胞的毒性，或者形成不溶的包含體，以及表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)的降解，因而可表達(dá)一些對(duì)細(xì)胞具有毒性的或者不穩(wěn)定、容易被降解的蛋白。減少了蛋白變性復(fù)性的困擾。另外，體外表達(dá)還可在體系內(nèi)添加特殊的修飾氨基酸或者標(biāo)記氨基酸，非常靈活，因而在蛋白質(zhì)折疊和蛋白質(zhì)功能研究上都有重要應(yīng)用。 
從原則上來說，各種細(xì)胞都可制備成供體外表達(dá)用的細(xì)胞裂解物。在實(shí)際操作中，常用的3類體外表達(dá)系統(tǒng)都源自于需要高效合成蛋白質(zhì)的細(xì)胞——原核系統(tǒng)的大腸桿菌細(xì)胞裂解物，真核細(xì)胞的兔網(wǎng)織紅細(xì)胞和麥胚細(xì)胞。要記住的是，真核體外表達(dá)體系并非只適用于真核基因，原核也并非只限于原核表達(dá)——在靈活的體外表達(dá)系統(tǒng)中，只要序列滿足啟動(dòng)子和核糖體結(jié)合位點(diǎn)的需求，系統(tǒng)均可匹配基因。生物通在后面特別介紹真核和原核體外表達(dá)的區(qū)別和幾種不同的體外表達(dá)體系的區(qū)別。羅氏(Roche)、Promega等幾家相當(dāng)有遠(yuǎn)見的公司，一直致力于體外表達(dá)的研究開發(fā)，所以今天，我們也就有了更多種選擇。 
體外表達(dá)(二)：原理和技術(shù)要點(diǎn) 
真核vs.原核 
我們前面提到過，體外表達(dá)常用的3類體系是原核的大腸桿菌體系，真核的兔網(wǎng)織紅細(xì)胞體系和麥胚細(xì)胞體系。對(duì)于無細(xì)胞的體外表達(dá)，基因，只要序列上滿足啟動(dòng)子和核糖體結(jié)合位點(diǎn)的要求，就可用任一體系進(jìn)行體外合成。3種不同選擇，主要是為了滿足優(yōu)化的需要。在決定選擇那種體系前， 生物通 帶你來看看原核和真核的反應(yīng)體系有哪些區(qū)別。 
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