細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇

一、原理

在不加條件下直接凍存細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞內(nèi)和外環(huán)境中的水都會(huì)形成冰晶，能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)生機(jī)械損傷、電解質(zhì)升高、滲透壓改變、脫水、PH改變、蛋白變性等，能引起細(xì)胞死亡。如向培養(yǎng)液加入保護(hù)劑，可使冰點(diǎn)降低。在緩慢的凍結(jié)條件下，能使細(xì)胞內(nèi)水份在凍結(jié)前透出細(xì)胞。貯存在－130℃以下的低溫中能減少冰晶的形成。

細(xì)胞復(fù)蘇時(shí)速度要快，使之迅速通過(guò)細(xì)胞易受損的－5～0℃，細(xì)胞仍能生長(zhǎng)，活力受損不大。

目前常用的保護(hù)劑為二甲亞砜（DMSO）和甘油，它們對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細(xì)胞。

二、操作步驟

（一）凍存

1、消化細(xì)胞（同實(shí)驗(yàn)二），將細(xì)胞懸液收集至離心管中。

2、1000rpm離心10分鐘，棄上清液。

3、沉淀加含保護(hù)液的培養(yǎng)，計(jì)數(shù)，調(diào)整至5×106/ml左右。

4、將懸液分至凍存管中，每管1 ml。

5、將凍存管口封嚴(yán)。如用安瓿瓶則火焰封口，封口要嚴(yán)，否則復(fù)蘇時(shí)易出現(xiàn)爆裂。

6、貼上標(biāo)簽，寫明細(xì)胞種類，凍存日期。凍存管外拴一金屬重物和一細(xì)繩。

7、按下列順序降溫：室溫→4℃（20分鐘）→冰箱冷凍室（30分鐘）→低溫冰箱（－30℃ 1小時(shí)）→氣態(tài)氮（30分鐘）→液氮。

注意：操作時(shí)應(yīng)小心，以免液氮**。液氮定期檢查，隨時(shí)補(bǔ)充，不能揮發(fā)干凈，一般30立升的液氮能用1～1.5月。

（二）復(fù)蘇

1、準(zhǔn)備一個(gè)茶缸或1000ml的燒壞，內(nèi)裝2/3杯37℃的溫水。

2、從液氮中取出凍存管、迅速置于溫水中并不斷攪動(dòng)。使凍存管中的凍存物在1分鐘之內(nèi)融化。

3、打開凍存管，將細(xì)胞懸液吸到離心管中。

4、1000rpm離心10分鐘，棄去上清液。

5、沉淀加10ml培養(yǎng)液，吹打均勻，再離心10分鐘，棄上清液。

6、加適當(dāng)培養(yǎng)基后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，37℃培養(yǎng)，**天觀察生長(zhǎng)情況。

三、試劑和器材

器材：液氮罐、凍存管（塑料螺口專用凍存管或安瓿瓶）、離心管、吸管、離心機(jī)等

試劑：0.25％胰酶、培養(yǎng)基、含保護(hù)劑的培養(yǎng)基（即凍存液）

附：凍存液配制：

培養(yǎng)基加入甘油或DSMO，使其終濃度達(dá)5—20%。保護(hù)劑的種類和用量視不同細(xì)胞而不同。配好后4℃下保存。

細(xì)胞周期的測(cè)定

一、原理

細(xì)胞周期指細(xì)胞一個(gè)世代所經(jīng)歷的時(shí)間。從一次細(xì)胞分裂結(jié)束到下一次分裂結(jié)束為一個(gè)周期。細(xì)胞周期反應(yīng)了細(xì)胞增殖速度。

單個(gè)細(xì)胞的周期測(cè)定可采用縮時(shí)攝影的方法，但它不能代表細(xì)胞群體的周期，故現(xiàn)多采用其他方法測(cè)群體周期。

測(cè)定細(xì)胞周期的方法很多，有同位素標(biāo)記法、細(xì)胞計(jì)數(shù)法等，這里介紹一種利用BrdU滲入測(cè)定細(xì)胞周期的方法。

BrdU（5-溴脫氧尿嘧啶核苷）加入培養(yǎng)基后，可做為細(xì)胞DNA復(fù)制的原料，經(jīng)過(guò)兩個(gè)細(xì)胞周期后，細(xì)胞中兩條單鏈均含BrdU的DNA將占l/2，反映在染色體上應(yīng)表現(xiàn)為一條單體淺染。如經(jīng)歷了三個(gè)周期，則染色體中約一半為兩條單體均淺染，另一半為一深一淺。細(xì)胞如果僅經(jīng)歷了一個(gè)周期，則兩條單體均深染。計(jì)分裂相中各期比例，就可算出細(xì)胞周期的值。

二、儀器、用品與試劑

1、儀器、用品：同常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)

2、試劑：BrdU（1.0mg/ml），甲醇、冰醋酸，Giemsa染液，秋水仙素，2×SSC液

三、操作步驟

1、細(xì)胞生長(zhǎng)至指數(shù)期時(shí)，向培養(yǎng)液中加入BrdU，使終濃度為10μg/ml。

2、44小時(shí)加秋水仙素，使每ml中含0.1μg。

3、48小時(shí)后常規(guī)消化細(xì)胞至離心管中，注意培養(yǎng)上清的漂浮細(xì)胞也要收集到離心管中。

4、常規(guī)染色體制片（見第三部分：染色體技術(shù)）。

5、染色體玻片置56℃水浴鍋蓋上，鋪上2×SSC 液，距紫外燈管6cm處紫外照射30分鐘。

6、棄去2×SSC液，流水沖洗。

7、Giemsa液染色10分鐘，流水沖洗，晾干。

8、鏡檢100個(gè)分裂相，計(jì)、二、三、四細(xì)胞期分裂指數(shù)。

9、計(jì)算： 細(xì)胞周期（Tc）=48/{（M1+2M2+3M3+4M4）/100}（小時(shí)）

附：（1）BrdU配制: BrdU 10mg十雙蒸水10ml 4℃下避光保存。

（2）2×SSC配制: NaCl 1.75克，檸檬酸三鈉•2H2O 0.88克，加水至100ml，4℃保存。

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