◆ 概述

   原位雜交組織(或細(xì)胞)化學(xué) (In situ Hybridization Histochemistry, ISHH) 簡(jiǎn)稱原位雜交(In Situ Hybridization)，屬于固相分子雜交的范疇，它是用標(biāo)記的DNA或RNA為探針，在原位檢測(cè)組織細(xì)胞內(nèi)特定核酸序列的方法。根據(jù)所用探針和靶核酸的不同

，原位雜交可分為DNA-DNA雜交，DNA-RNA雜交和RNA-RNA雜交三類。根據(jù)探針的標(biāo)記物是否直接被檢測(cè)，原位雜交又可分為直接法和間接法兩類。直接法主要用放射性同位素、熒光及某些酶標(biāo)記的探針與靶核酸進(jìn)行雜交，雜交后分別通過(guò)放射自顯影、熒光顯微鏡術(shù)或成色酶促反應(yīng)直接顯示。間接法一般用半抗原標(biāo)記探針，后通過(guò)**組織化學(xué)法對(duì)半抗原定位，間接地顯示探針與靶核酸形成的雜交體。

   原位雜交能在成分復(fù)雜的組織中進(jìn)行單一細(xì)胞的研究而不受同一組織中其他成分的影響，因此對(duì)于那些細(xì)胞數(shù)量少且散在于其他組織中的細(xì)胞內(nèi)DNA或RNA研究更為方便；同時(shí)由于原位雜交不需要從組織中提取核酸，對(duì)于組織中含量極低的靶序列有極高的敏感性，并可完整地保持組織與細(xì)胞的形態(tài)，更能準(zhǔn)確地反映出組織細(xì)胞的相互關(guān)系及功能狀態(tài)。

◆ 操作流程

   原位雜交反應(yīng)（以DIG-cDNA探針為例）：

   取材

   ● 0.1M PBS (pH 7.2) 浸 5-10min。

   ● 0.1M甘氨酸/0.1M PBS 浸5min。

   ● 0.3%TritonX-100/0.1M PBS 浸10-15min。

   ● 0.1M PBS 洗 5min×3次，加蛋白酶K(1μg/ml)，37℃孵育30 min。

   ● 4%多聚甲醛浸5min。

   ● 0.1M PBS 洗 5min×2次，浸入新鮮配制的含0.25%乙酸酐/0.1M三乙醇胺中10min。

   ● 預(yù)雜交：滴加適量預(yù)雜交液，42℃ 30 min。

   ● 雜交：傾去預(yù)雜交液，在每張切片上滴加10-20μl雜交液（將探針變性后稀釋在預(yù)雜交液中，0.5 ng/μl ），覆以蓋玻片或蠟?zāi)ぃ?2℃ 過(guò)夜。（陰性對(duì)照）

   ● 洗片：(1) 4×SSC、2×SSC、1×SSC、0.5×SSC 37℃各洗20min；0.2×SSC 37℃洗10min；0.2×SSC與0.1M PBS各半洗10min；0.05M PBS 洗 5min×2次。

   ● 3% BSA/0.05M PBS 包被，37℃ 30min.

   ● 滴加抗地高辛-抗血清堿性磷酸酶復(fù)合物（以抗體稀釋液1:5000稀釋）4℃孵育過(guò)夜。

   ● 0.05M PBS洗15min×4次; TSM1 10min×2次; 新鮮配制TSM2 10min×2次。

   ● 顯色：在玻片上滴加適量顯色液，4℃避光過(guò)夜。

   ● 將玻片置于TE中10-30min以終止反應(yīng)。

   ● 酒精梯度脫水、二甲苯脫脂。

   ● 中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察結(jié)果。