1. 一抗，二抗的比例怎么樣？

解答：比較重要，調(diào)整好一抗，二抗的比例，去掉部分非特異的本底。

2. 做細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，要做磷酸化某因子Western Blot，其二抗有何要求？

解答：對(duì)二抗無要求，根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件來選擇，一般選HRP標(biāo)記的二抗。

3. 公司內(nèi)的另外抗體用這個(gè)稀釋度做出來效果很好，所以沒做預(yù)試，怕費(fèi)時(shí)間，用什么樣的稀釋度比較好呢？我用的ELL+plus試劑盒顯色。轉(zhuǎn)膜過夜，一抗孵育也是過夜的，若封閉也過夜的話就要四天才看的到結(jié)果了。

解答：不同抗體，即使是同一公司的抗體，其佳的抗體稀釋度也是不一樣的，需要你實(shí)驗(yàn)摸索。我覺得轉(zhuǎn)膜過夜好像沒有必要吧，轉(zhuǎn)膜的目的也就是將蛋白轉(zhuǎn)到膜上就行啦，何必浪費(fèi)時(shí)間呢。至于具體的轉(zhuǎn)膜時(shí)間，還要看你的目的蛋白分子量的大?。晦D(zhuǎn)膜的設(shè)備，是半干式，還是濕式。一抗當(dāng)然可以過夜，如果你想所短Western Blot時(shí)間的話，可以增高一抗的孵育溫度，我們實(shí)驗(yàn)室一般37度，兩小時(shí)就足夠了；你可以參照抗體說明書。至于一抗和二抗得稀釋度，你可以一抗1：1500；二抗1：20000試試。另外建議你洗膜時(shí)，多洗幾次，好是在封閉；一抗和二抗后至少是5x5min，跑一張好膜不容易，多盡點(diǎn)心吧，這樣不會(huì)浪費(fèi)你的時(shí)間，只會(huì)節(jié)省你的時(shí)間！

4. **組化和Western Blot可以用同一種抗體嗎？

解答：**組化時(shí)抗體識(shí)別的是未經(jīng)變性處理的抗原決定簇（又稱表位），有些表位是線性的，而有的屬于構(gòu)象型；線性表位不受蛋白變性的影響，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；構(gòu)象型表位由于受蛋白空間結(jié)構(gòu)限制，煮后變性會(huì)消失。如果你所用的抗體識(shí)別的是蛋白上連續(xù)的幾個(gè)氨基酸，也就是線性表位，那么這種抗體可同時(shí)用于**組化和Western，而如果抗體識(shí)別構(gòu)象形表位，則只能用于**組化。一般抗體說明書上都有注明此種抗體識(shí)別的氨基酸區(qū)間。（限于單抗）

5. Western Blot 中抗體的重復(fù)應(yīng)用問題

解答：抗體工作溶液一般不主張儲(chǔ)存反復(fù)使用，但是如抗體比較珍貴，可反復(fù)使用2－3次。稀釋后應(yīng)在2－3天內(nèi)使用，4度保存，避免反復(fù)凍融。

目前，基爾頓生物科技（上海）有限公司，主營實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)服務(wù)、服務(wù)、動(dòng)物模型構(gòu)建、細(xì)胞株、elisa試劑盒等，歡迎廣大科研愛好者前來咨詢！