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技術(shù)**

怎么準確的凍存細胞


怎么準確的凍存細胞     

一、資料

（一）儀器 　　1. 凈化作業(yè)臺 　　2. 離心機 　　3. 恒溫水浴箱 　　4. 冰箱（4℃、-20℃、-70℃） 　　5. 倒置相差顯微鏡 　　6. 培育箱 　　7. 液氮冰箱

（二）玻璃器皿 　　1. 吸管（彎頭、直頭） 　　2. 培育瓶 　　3. 玻璃瓶（250ml、100ml） 　　4. 廢液缸

（三）塑料器皿 　　1. 吸頭 　　2. 槍頭 　　3. 膠塞 　　4. 移液管（10ml） 　　5. 15ml離心管 　　6. 凍存管（1～2ml）

（四）別的物品 　　1. 微量加樣槍 　　2. 紅血球計數(shù)板 　　3. 記號筆 　　4. 醫(yī)用橡皮膏 　　5. 移液槍

（五）試劑 　　1. D-Hanks液 　　2. 小牛血清 　　3. 培育液 　　4. 雙抗（青霉素、鏈霉素） 　　5. 胰蛋白酶（0.08%） 　　6. 1NHCl 7. 7.4%NaHCO3 　　8. DMSO（剖析純）或無色新鮮甘油
二、操作過程

（一）細胞凍存 

1. 制造含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的凍存培育液；

2. 取對數(shù)成長期的細胞，用胰蛋白酶把單層成長的細胞消化下來，懸浮成長的細胞則直接將細胞移至15ml離心管中、；

3. 離心1000rpm，5min；

4. 去掉胰蛋白酶及舊的培育液，參加適當(dāng)制造好的凍存培育液，用吸管悄悄吹打使細胞均勻，計數(shù)，調(diào)理凍存液中細胞的終密度為5×106/ml～1×107/ml；

5. 將細胞分裝入凍存管中，每管1～1.5 ml；

6. 在凍存管上標(biāo)明細胞的稱號，凍存時間及操作者；

7. 凍存：規(guī)范的凍存程序為降溫速率-1～-2℃/ min；當(dāng)溫度達-25℃以下時，可增至-5℃～-10℃/ 　　min；到-100℃時，則可敏捷浸入液氮中。也可將裝有細胞的凍存管放入-20℃冰箱2h ，然后放入-70℃冰箱中**，取出

凍存管，移入液氮容器內(nèi)。

（二） 細胞復(fù)蘇

1. 從液氮容器中取出凍存管，直接浸入37℃溫水中，并不時搖動令其盡快消融。

2. 從37℃水浴中取出凍存管，打開蓋子，用吸管吸出細胞懸液，加到離心管并滴加10倍以上培育液，混勻；

3. 離心， 1000rpm，5min；

4. 棄去上清液，參加含10%小牛血清培育液重懸細胞，計數(shù)，調(diào)整細胞密度，接種培育瓶，37℃培育箱靜置培育；

5. 次日更換一次培育液，持續(xù)培育。

三、注意事項

1．從增殖期到構(gòu)成細密的單層細胞曾經(jīng)的培育細胞都可以用于凍存，但好為對數(shù)成長期細胞。在凍存前**好換一次培育液；

2．將凍存管放入液氮容器或從中取出時，要做好防護作業(yè)，避免**；

3．凍存和復(fù)蘇好用新制造的培育液。