大鼠原代心肌細(xì)胞提取方法

原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)是體外研究心血管**相關(guān)機(jī)制的主要手段和基本技術(shù) 基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中，與細(xì)胞系相比，原代心肌細(xì)胞的形態(tài)及電生理方面更接近在體細(xì)胞，因此，培養(yǎng)原代心肌細(xì)胞的質(zhì)量直接關(guān)系實(shí)驗(yàn)的進(jìn)程及結(jié)果。

乳鼠原代心肌細(xì)胞分離須注意以下幾點(diǎn)：

1.鼠齡的選擇：新生1-3d齡，好半日齡。

新生大鼠心肌細(xì)胞在出生后3 d內(nèi)具有部分的增殖能力，成年大鼠心肌細(xì)胞則為終末分化細(xì)胞，不再具有分裂增殖能力。因此，大鼠出生時(shí)間越短，心肌細(xì)胞分離后成活率越高，越容易貼壁生長。建議選擇1~3 d齡大鼠分離其心肌細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)。

2.消化酶的選擇：胰蛋白酶和膠原酶混合使用（0.4%膠原酶:0.05%胰酶=2:1）。

 常用的消化酶有2種：胰蛋白酶和膠原酶，胰蛋白酶作用較強(qiáng)，容易造成心肌細(xì)胞損壞，膠原酶作用較緩和，能消化細(xì)胞間質(zhì)中的膠原纖維以釋放細(xì)胞，對細(xì)胞損傷小。

3.消化程度的把握：組織由紅轉(zhuǎn)白呈半透明狀態(tài)時(shí)，停止消化。

新生大鼠心肌細(xì)胞對消化酶極為敏感。消化不足，細(xì)胞聚集成團(tuán)，無法得到單層細(xì)胞，不利于觀察和后續(xù)實(shí)驗(yàn)；消化過度可使肌原纖維出現(xiàn)萎縮，細(xì)胞死亡率增加或喪失貼壁能力及搏動(dòng)能力；消化的適宜溫度為35~37℃。

4.抑制成纖維細(xì)胞生長：加入BrdU，更換小牛血清。

分離出來的心肌細(xì)胞會(huì)伴有較多成纖維細(xì)胞，成纖維細(xì)胞具有較強(qiáng)增殖能力會(huì)干預(yù)心肌細(xì)胞的貼壁和增殖，需要盡量去除成纖維細(xì)胞。成纖維細(xì)胞較心肌細(xì)胞更容易貼壁，可以通過差速貼壁去除大部分成纖維細(xì)胞，但仍有少量成纖維細(xì)胞混雜于心肌細(xì)胞之中。溴脫氧尿苷(bromodeoxyuridine, BrdU)可干擾細(xì)胞的有絲分裂，故常規(guī)使用BrdU抑制成纖維細(xì)胞的生長。由于胎牛血清所含的促細(xì)胞有絲分裂的因子較多，BrdU很難抑制成纖維細(xì)胞的生長.改用小牛血清則可克服這種現(xiàn)象的出現(xiàn)，獲得高達(dá)90％以上的心肌細(xì)胞。

5. 培養(yǎng)液pH值：pH范圍在7.2~7.4之間。

操作過程：

1. 手持大鼠乳鼠（出生24h內(nèi)），75%乙醇**皮膚，剪開胸部皮膚，再**1次，更換手術(shù)器械，彎鑷提取心臟，置于盛有PBS（1:50雙抗）的大皿中；

2. 將心臟表面附著的大血管剪去，剪去心房，放入5ml**離心管中充分剪碎成肉泥狀；

3. 加3ml左右膠原酶和1.5ml 0.05%胰酶充分吹勻，37℃消化8 min，自然沉淀，棄上清，再加3ml左右膠原酶和1.5ml0.05%胰酶，充分吹勻，37℃消化10min；

4.  取上清， 3000 rpm 5min，鋪中皿加含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基（記1），剩余沉淀中加入3ml左右膠原酶和1.5ml0.5%胰酶，充分吹勻，37℃消化10min；

5. 重復(fù)4的步驟4-5次，直至組織塊消化完畢，記（2-5）

6. 放培養(yǎng)箱2到3小時(shí)待成纖維細(xì)胞貼壁后輕輕吹打培養(yǎng)基，所有的中皿上清移入離心管離心3000 rpm 5min，棄上清，加含有10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基以及Brdu（10mM）（1:80），鋪中皿培養(yǎng)。

7. 48h換液后可得心肌細(xì)胞。觀察心肌細(xì)胞形態(tài)及搏動(dòng)狀況。

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